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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR污染，存在假阳性带，，盼大神急救
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yafen0628

金虫 (正式写手)

[求助] PCR污染，存在假阳性带，，盼大神急救 已有3人参与

我在PCR过程中遇到很奇葩的现象，阴性对照组（模板为水），会P出来阳性条带，而且与目的带（目的带在186bp左右）大小在同一位置。
1，尝试了更换不同的退火温度（58/62/65），假阳性带依然存在。。。。,
2，曾经以为假阳性带会是交叉引物二聚体类产物，尝试了PCR体系中添加5%DMSO以及将引物100℃煮沸再用，结果还是存在假阳性。。
3，试着换掉了TAQ酶及DNTP还有水，依然是徒劳。。。

下图的左一模板为水，后面依次为不同浓度的阳性模板。。PCR的退火温度为58℃，循环数目35.

我想请教下各位大神，还有什么好的办法来找到PCR污染或者假阳性带的原因，或者是不是因为目的带偏小，所以才会遇到这种问题呢，尝试了各种办法，最近真是被愁死了，要P疯了。。。

PCR污染，存在假阳性带，，盼大神急救
20170516  HHV8 35 cycle.JPG
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1楼 2017-06-22 21:34:28
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971731043

新虫 (职业作家)
可以在超净台里试试，可能引物被污染了

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5楼2017-06-23 09:04:09
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
气溶胶污染，换引物，在做下去也不会太好的。
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2017-06-23 10:39:56
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as1688816

木虫 (正式写手)
估计是酶问题？你是不是用的mix扩的？可以换个牌子试试，或者不用mix

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2楼2017-06-22 23:21:05
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yafen0628

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 781055707 at 2017-06-23 10:39:56
气溶胶污染，换引物，在做下去也不会太好的。

重新开启了新合成的引物，结果是一样的。然后重新设计了其他的引物（目的片段均比较小，小于200），还是有这种现象出现。难道会是PCR的退火温度需要再摸索？

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7楼2017-06-23 13:04:52
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as1688816

木虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-23 23:23:05
引用回帖:
3楼: Originally posted by yafen0628 at 2017-06-23 06:48:17
不是mix ，酶是用的thermo的
...

哦，那就不知道原因了，我以前也遇到过这种问题，不过我用的是mix,当时换个mix就好了，也怀疑过水有问题，不过换了很多水还是有带，一般是很短的片段，如果扩的是很长的片段，一般不会有带的。

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4楼2017-06-23 08:30:53
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普通回帖

yafen0628

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by as1688816 at 2017-06-22 23:21:05
估计是酶问题？你是不是用的mix扩的？可以换个牌子试试，或者不用mix

不是mix ，酶是用的thermo的

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3楼2017-06-23 06:48:17
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yafen0628

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 971731043 at 2017-06-23 09:04:09
可以在超净台里试试，可能引物被污染了

在超净台试过了，抢也换了其他的。。。然而，没有用。。。

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8楼2017-06-23 13:06:26
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971731043

新虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yafen0628 at 2017-06-23 13:06:26
在超净台试过了，抢也换了其他的。。。然而，没有用。。。
...

可能你的引物母液就已经被污染了

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9楼2017-06-23 14:42:44
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yafen0628 at 2017-06-23 13:04:52
重新开启了新合成的引物，结果是一样的。然后重新设计了其他的引物（目的片段均比较小，小于200），还是有这种现象出现。难道会是PCR的退火温度需要再摸索？
...

换其他基因呀。
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采菊东篱下，悠然见南山。
10楼2017-06-23 15:31:25
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