应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » TA克隆连接方向问题，实验室小白，求大神们指教！
211/3返回列表123下一页
查看: 3392  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

linhanmm

新虫 (初入文坛)

[求助] TA克隆连接方向问题，实验室小白，求大神们指教！ 已有4人参与

TA连接方向问题。我用pMD19T simple 和带有BamH1和Hind3的PCR产物链接，怎么验证它的连接方向呢？   我接下来要连接到pET-32a 上表达，已经确定用这两个酶切位点可以正向连在pET-32a上了，还需要验证PCR产物在克隆载体上的方向吗？

@youlinglyw 发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

linhanmm

» 猜你喜欢
1楼 2017-06-09 09:23:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

一叶知秋365

新虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by linhanmm at 2017-06-09 09:23:46
TA连接方向问题。我用pMD19T simple 和带有BamH1和Hind3的PCR产物链接，怎么验证它的连接方向呢？   我接下来要连接到pET-32a 上表达，已经确定用这两个酶切位点可以正向连在pET-32a上了，还需要验证PCR产物在克隆载 ...

不需要验证方向吧，可以酶切连接的。

发自小木虫Android客户端
赞一下(2人) 回复此楼
14楼2017-06-10 07:15:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MulanQahar

金虫 (正式写手)
第一种方法，Sequencing. 第二种是，找一个离bamh 1 或 离hind3 近的digestion site. 然后用双酶切

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

linhanmm
4楼2017-06-09 10:03:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MulanQahar

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by linhanmm at 2017-06-09 10:10:55
还有一点不明白，为什么要验证方向呢？切下来后不连在表达载体上一样吗？我的理论基础有些差，还请多指教。
...

用双酶切的时候，一般不会有这种情况。但是常常有很多的意外发生。比如mutation. 还有就是，你的pcr 产物或许有问题的情况也都有。因为pcr的时候，能读的长度是有限的。

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2017-06-09 10:38:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
17楼: Originally posted by 一叶知秋365 at 2017-06-10 15:01:09
这个要注意的，不过你只要酶切位点正确，基本方向不会有啥问题。最好测序看一下。
...

我怎么确定这个方向呢？酶切位点在设计的时候就要注意其是否在5'还是3'端吗？

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
18楼2017-06-10 12:06:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

linhanmm

新虫 (初入文坛)
送红花一朵


发自小木虫IOS客户端
2楼2017-06-09 09:53:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linhanmm

新虫 (初入文坛)
别沉啊，求大神们指教啊！送红花～给金币哦！

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2017-06-09 09:54:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linhanmm

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by MulanQahar at 2017-06-09 10:03:36
第一种方法，Sequencing. 第二种是，找一个离bamh 1 或 离hind3 近的digestion site. 然后用双酶切

Simple 载体上没有酶切位点的～测序的话也想过，不过需要花钱，如果实在是没办法也就只能测序了～

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
5楼2017-06-09 10:08:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linhanmm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by MulanQahar at 2017-06-09 10:03:36
第一种方法，Sequencing. 第二种是，找一个离bamh 1 或 离hind3 近的digestion site. 然后用双酶切

还有一点不明白，为什么要验证方向呢？切下来后不连在表达载体上一样吗？我的理论基础有些差，还请多指教。

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
6楼2017-06-09 10:10:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MulanQahar

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linhanmm at 2017-06-09 10:08:26
Simple 载体上没有酶切位点的～测序的话也想过，不过需要花钱，如果实在是没办法也就只能测序了～
...

pcr 产物没有酶切点?

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
7楼2017-06-09 10:27:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linhanmm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by MulanQahar at 2017-06-09 10:27:10
pcr 产物没有酶切点?
...

PCR产物上有酶切位点，BamH1和Hind3。但是载体上没有其他的酶切位点了，也就是说连完后的重组DNA上就只有这两个酶切位点。

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
8楼2017-06-09 10:34:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MulanQahar

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
8楼: Originally posted by linhanmm at 2017-06-09 10:34:44
PCR产物上有酶切位点，BamH1和Hind3。但是载体上没有其他的酶切位点了，也就是说连完后的重组DNA上就只有这两个酶切位点。
...

不要找载体上的切点。找pcr产物上的切点。除了那两个。知道你的pcr产物的sequence吗？用NEB cutter 可以找到酶切点

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
10楼2017-06-09 10:45:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 linhanmm 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料学调剂 +7 提神豆沙包 2026-02-28 9/450 2026-03-01 11:50 by 王伟要上岸啊
[考研] 材料284求调剂，一志愿郑州大学英一数二 +7 想上岸的土拨鼠 2026-02-28 7/350 2026-03-01 11:44 by 月下best
[考研] 311求调剂 +9 南迦720 2026-02-28 10/500 2026-03-01 10:55 by sunny81
[考研] 291分工科求调剂 +7 science饿饿 2026-03-01 8/400 2026-03-01 10:43 by sunny81
[考研] 0856化工专硕求调剂 +5 董boxing 2026-03-01 5/250 2026-03-01 10:41 by sunny81
[考研] 272求调剂 +4 材紫有化 2026-02-28 4/200 2026-03-01 09:20 by L135790
[论文投稿] 求助coordination chemistry reviews 的写作模板 10+3 ljplijiapeng 2026-02-27 4/200 2026-03-01 09:07 by babero
[论文投稿] Optics letters投稿被拒求助 30+3 luckyry 2026-02-26 4/200 2026-03-01 09:06 by babero
[考研] 298求调剂 +5 axyz3 2026-02-28 5/250 2026-03-01 06:45 by 刘兵
[考研] 材料调剂 +4 爱擦汗的可乐冰 2026-02-28 4/200 2026-03-01 00:38 by 猫猫球alter
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧？ +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
[考研] 304求调剂 +3 52hz~~ 2026-02-28 5/250 2026-03-01 00:00 by 52hz~~
[考研] 292求调剂 +3 yhk_819 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:57 by gaoxiaoniuma
[考博] 26申博 +4 想申博！ 2026-02-26 4/200 2026-02-28 21:37 by limorning
[考研] 264求调剂 +3 巴拉巴拉根556 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:31 by gaoxiaoniuma
[考研] 085600材料工程一志愿中科大总分312求调剂 +8 吃宵夜1 2026-02-28 10/500 2026-02-28 20:27 by L135790
[考研] 0856材料求调剂 +10 hyf hyf hyf 2026-02-28 11/550 2026-02-28 18:50 by 无际的草原
[考研] 265分求调剂不调专业和学校有行学上就 +4 礼堂丁真258 2026-02-28 6/300 2026-02-28 16:18 by 求调剂zz
[考研] 0856调剂 +3 刘梦微 2026-02-28 3/150 2026-02-28 13:22 by houyaoxu
[考研] 304求调剂 +5 曼殊2266 2026-02-28 6/300 2026-02-28 12:44 by 迷糊CCPs
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭