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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » TA克隆连接方向问题，实验室小白，求大神们指教！
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的PCR产物已经加好酶切位点了，而且能够用于下一步载体构建，那么就不需要确定什么正反向了。直接测序确定序列之后，直接摇菌提质粒 双酶切 连接 就可以了
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linhanmm
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
11楼2017-06-09 10:56:31
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linhanmm

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-09 10:56:31
你的PCR产物已经加好酶切位点了，而且能够用于下一步载体构建，那么就不需要确定什么正反向了。直接测序确定序列之后，直接摇菌提质粒 双酶切 连接 就可以了

thank you～

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12楼2017-06-09 11:34:39
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矮腿妹的烦恼

新虫 (初入文坛)
进行测序

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13楼2017-06-09 21:43:41
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一叶知秋365

新虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by linhanmm at 2017-06-09 09:23:46
TA连接方向问题。我用pMD19T simple 和带有BamH1和Hind3的PCR产物链接，怎么验证它的连接方向呢？   我接下来要连接到pET-32a 上表达，已经确定用这两个酶切位点可以正向连在pET-32a上了，还需要验证PCR产物在克隆载 ...

不需要验证方向吧，可以酶切连接的。

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14楼2017-06-10 07:15:07
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Huobol

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
14楼: Originally posted by 一叶知秋365 at 2017-06-10 07:15:07
不需要验证方向吧，可以酶切连接的。
...

不用测定方向，测序正确即可。非得测序方向的话，用M13F-47测序引物与目的基因下游引物做质粒PCR或菌液PCR，或者M13R-48与目的基因上游引物，产物电泳出现理论大小的亮带，即为正向。

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linhanmm
让羽毛再飞一会儿
15楼2017-06-10 07:40:19
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
我想请问一下，在连接到pET-32的时候得注意方向吗？怎么看方向呢？

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16楼2017-06-10 08:04:53
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一叶知秋365

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 渊博震天 at 2017-06-10 08:04:53
我想请问一下，在连接到pET-32的时候得注意方向吗？怎么看方向呢？

这个要注意的，不过你只要酶切位点正确，基本方向不会有啥问题。最好测序看一下。

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17楼2017-06-10 12:01:09
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
17楼: Originally posted by 一叶知秋365 at 2017-06-10 15:01:09
这个要注意的，不过你只要酶切位点正确，基本方向不会有啥问题。最好测序看一下。
...

我怎么确定这个方向呢？酶切位点在设计的时候就要注意其是否在5'还是3'端吗？

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18楼2017-06-10 12:06:35
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一叶知秋365

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
18楼: Originally posted by 渊博震天 at 2017-06-10 12:06:35
我怎么确定这个方向呢？酶切位点在设计的时候就要注意其是否在5'还是3'端吗？
...

是的。在设计引物时就要注意酶切位点，你的5'端用bamhi ，3端用hindIII是可以的，方向不会有问题。载体构建好后你可以进行测序验证，也可以pcr验证，用T7promoter引物和你的3’端引物进行PCR，能p出来就是正向。

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19楼2017-06-10 12:14:36
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
19楼: Originally posted by 一叶知秋365 at 2017-06-10 15:14:36
是的。在设计引物时就要注意酶切位点，你的5'端用bamhi ，3端用hindIII是可以的，方向不会有问题。载体构建好后你可以进行测序验证，也可以pcr验证，用T7promoter引物和你的3’端引物进行PCR，能p出来就是正向。
...

我就是想问一下通过质粒图谱，怎么确定酶切位点应该放在5'还是3'端？

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20楼2017-06-10 12:16:18
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