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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » TA克隆连接方向问题，实验室小白，求大神们指教！
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linhanmm

新虫 (初入文坛)

[求助] TA克隆连接方向问题，实验室小白，求大神们指教！ 已有4人参与

TA连接方向问题。我用pMD19T simple 和带有BamH1和Hind3的PCR产物链接，怎么验证它的连接方向呢？   我接下来要连接到pET-32a 上表达，已经确定用这两个酶切位点可以正向连在pET-32a上了，还需要验证PCR产物在克隆载体上的方向吗？

@youlinglyw 发自小木虫IOS客户端
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linhanmm

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1楼 2017-06-09 09:23:46
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一叶知秋365

新虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by linhanmm at 2017-06-09 09:23:46
TA连接方向问题。我用pMD19T simple 和带有BamH1和Hind3的PCR产物链接，怎么验证它的连接方向呢？   我接下来要连接到pET-32a 上表达，已经确定用这两个酶切位点可以正向连在pET-32a上了，还需要验证PCR产物在克隆载 ...

不需要验证方向吧，可以酶切连接的。

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14楼2017-06-10 07:15:07
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MulanQahar

金虫 (正式写手)
第一种方法，Sequencing. 第二种是，找一个离bamh 1 或 离hind3 近的digestion site. 然后用双酶切

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linhanmm
4楼2017-06-09 10:03:36
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MulanQahar

金虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by linhanmm at 2017-06-09 10:10:55
还有一点不明白，为什么要验证方向呢？切下来后不连在表达载体上一样吗？我的理论基础有些差，还请多指教。
...

用双酶切的时候，一般不会有这种情况。但是常常有很多的意外发生。比如mutation. 还有就是，你的pcr 产物或许有问题的情况也都有。因为pcr的时候，能读的长度是有限的。

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9楼2017-06-09 10:38:47
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
17楼: Originally posted by 一叶知秋365 at 2017-06-10 15:01:09
这个要注意的，不过你只要酶切位点正确，基本方向不会有啥问题。最好测序看一下。
...

我怎么确定这个方向呢？酶切位点在设计的时候就要注意其是否在5'还是3'端吗？

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18楼2017-06-10 12:06:35
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普通回帖

linhanmm

新虫 (初入文坛)
送红花一朵


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2楼2017-06-09 09:53:54
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linhanmm

新虫 (初入文坛)
别沉啊，求大神们指教啊！送红花～给金币哦！

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3楼2017-06-09 09:54:27
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linhanmm

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by MulanQahar at 2017-06-09 10:03:36
第一种方法，Sequencing. 第二种是，找一个离bamh 1 或 离hind3 近的digestion site. 然后用双酶切

Simple 载体上没有酶切位点的～测序的话也想过，不过需要花钱，如果实在是没办法也就只能测序了～

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5楼2017-06-09 10:08:26
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linhanmm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by MulanQahar at 2017-06-09 10:03:36
第一种方法，Sequencing. 第二种是，找一个离bamh 1 或 离hind3 近的digestion site. 然后用双酶切

还有一点不明白，为什么要验证方向呢？切下来后不连在表达载体上一样吗？我的理论基础有些差，还请多指教。

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6楼2017-06-09 10:10:55
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MulanQahar

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linhanmm at 2017-06-09 10:08:26
Simple 载体上没有酶切位点的～测序的话也想过，不过需要花钱，如果实在是没办法也就只能测序了～
...

pcr 产物没有酶切点?

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7楼2017-06-09 10:27:10
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linhanmm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by MulanQahar at 2017-06-09 10:27:10
pcr 产物没有酶切点?
...

PCR产物上有酶切位点，BamH1和Hind3。但是载体上没有其他的酶切位点了，也就是说连完后的重组DNA上就只有这两个酶切位点。

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8楼2017-06-09 10:34:44
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MulanQahar

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
8楼: Originally posted by linhanmm at 2017-06-09 10:34:44
PCR产物上有酶切位点，BamH1和Hind3。但是载体上没有其他的酶切位点了，也就是说连完后的重组DNA上就只有这两个酶切位点。
...

不要找载体上的切点。找pcr产物上的切点。除了那两个。知道你的pcr产物的sequence吗？用NEB cutter 可以找到酶切点

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10楼2017-06-09 10:45:18
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