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求各位生物专业类大神解惑！！！急～～ 已有2人参与
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本人生物类专业本科一枚，毕业课题中的内容有一点儿疑惑：克隆得到一个基因片段，通过酶切连接的方法与L4440质粒构成重组质粒，转化感受态细胞，涂板后挑取了单菌落。摇菌培养后，直接以基因片段的引物为引物，以菌液为模版进行PCR，扩出来的电泳条带会比直接克隆得到的基因片段条带大200bP左右吗？ 这是正常现象吗？ 为什么会出现这种现象啊？ 请各位生物专业类大神答疑解惑～ 十分感谢！！！ 发自小木虫IOS客户端 |
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2楼2017-06-05 07:56:22
伤何处
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3楼2017-06-05 11:21:25
远望集团
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4楼2017-06-05 19:39:05
5楼2017-06-05 21:33:01
6楼2017-06-05 21:33:22
送红花一朵 |
菌液PCR产物电泳条带显示比之前克隆出来的目标基因条带 大约大了200左右～ 另外测序结果显示是正确的，做菌液PCR的目的是为了验证构建重组表达载体中是否插入了目标基因，虽然菌液PCR电泳条带比目标基因条带长了，但拿去测序结果完全正确。不影响后续实验，但我现在面临毕业答辩，这一点儿不知道原因，感觉自己面临评委老师的提问无法解释～ 发自小木虫IOS客户端 |
7楼2017-06-05 21:40:47
伤何处
管理员
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8楼2017-06-05 22:13:18
【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-06-06 07:47:53
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| 楼主要看看你做pcr的酶的活性和保真性，活性特别高的酶会p出一些大一点的条带，但是测序没什么问题。要不就看跑胶上样的上样loading和电泳缓冲液，跑胶中样品盐离子浓度低会跑出偏大或者偏小的条带或者会有杂带，换个高盐离子浓度的上样loading条带就单一正常了。既然你有引物，可以做个菌落pcr鉴定再挑菌摇菌啊，之后提质粒酶切验证，最后酶切电泳图是最准的，酶切验证正确的送测序一般就看看有没有点突变了。你的毕业答辩要是加上酶切说服力会好一点，菌液PCR条带大也不是大问题了。 |
9楼2017-06-06 00:16:46
