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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求各位生物专业类大神解惑！！！急～～
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Lulu与璐璐

新虫 (正式写手)

[求助] 求各位生物专业类大神解惑！！！急～～ 已有2人参与

本人生物类专业本科一枚，毕业课题中的内容有一点儿疑惑：克隆得到一个基因片段，通过酶切连接的方法与L4440质粒构成重组质粒，转化感受态细胞，涂板后挑取了单菌落。摇菌培养后，直接以基因片段的引物为引物，以菌液为模版进行PCR，扩出来的电泳条带会比直接克隆得到的基因片段条带大200bP左右吗？
这是正常现象吗？
为什么会出现这种现象啊？
请各位生物专业类大神答疑解惑～
十分感谢！！！

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1楼 2017-06-04 23:50:46
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stephen.xie

铁虫 (正式写手)
不会吧，没遇到过，建议再p一次

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2楼2017-06-05 07:56:22
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-06 07:47:38
你是怎么知道长200bp左右？因为对于比较大的片段，差200bp在电泳时不太好区别的。还有你做菌液PCR的时候，是拿之前的基因片段做阳性对照么？然后一起跑胶？
不用太纠结这个结果，送去测序之后就知道 到底有没有多200bp了  

祝实验顺利
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

Lulu与璐璐
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
3楼2017-06-05 11:21:25
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远望集团

金虫 (正式写手)
可以测个序看看
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只要努力，一切皆有可能！更美的风景在那片更高的天空。。。
4楼2017-06-05 19:39:05
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Lulu与璐璐

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stephen.xie at 2017-06-05 07:56:22
不会吧，没遇到过，建议再p一次

在小木虫中一些帖子中也出现了类似的情况～构建的两个基因片段都是酱紫的情况～

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5楼2017-06-05 21:33:01
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Lulu与璐璐

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 远望集团 at 2017-06-05 19:39:05
可以测个序看看

测序结果显示无误

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6楼2017-06-05 21:33:22
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Lulu与璐璐

新虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-05 11:21:25
你是怎么知道长200bp左右？因为对于比较大的片段，差200bp在电泳时不太好区别的。还有你做菌液PCR的时候，是拿之前的基因片段做阳性对照么？然后一起跑胶？
不用太纠结这个结果，送去测序之后就知道 到底有没有多2 ...

菌液PCR产物电泳条带显示比之前克隆出来的目标基因条带 大约大了200左右～
另外测序结果显示是正确的，做菌液PCR的目的是为了验证构建重组表达载体中是否插入了目标基因，虽然菌液PCR电泳条带比目标基因条带长了，但拿去测序结果完全正确。不影响后续实验，但我现在面临毕业答辩，这一点儿不知道原因，感觉自己面临评委老师的提问无法解释～

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7楼2017-06-05 21:40:47
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Lulu与璐璐 at 2017-06-05 21:40:47
菌液PCR产物电泳条带显示比之前克隆出来的目标基因条带 大约大了200左右～
另外测序结果显示是正确的，做菌液PCR的目的是为了验证构建重组表达载体中是否插入了目标基因，虽然菌液PCR电泳条带比目标基因条带长了， ...

那就没问题呢。放心，评委老师应该不会发现你电泳条带上多了200bp这个问题的~
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
8楼2017-06-05 22:13:18
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凌绯韵

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-06-06 07:47:53
楼主要看看你做pcr的酶的活性和保真性，活性特别高的酶会p出一些大一点的条带，但是测序没什么问题。要不就看跑胶上样的上样loading和电泳缓冲液，跑胶中样品盐离子浓度低会跑出偏大或者偏小的条带或者会有杂带，换个高盐离子浓度的上样loading条带就单一正常了。既然你有引物，可以做个菌落pcr鉴定再挑菌摇菌啊，之后提质粒酶切验证，最后酶切电泳图是最准的，酶切验证正确的送测序一般就看看有没有点突变了。你的毕业答辩要是加上酶切说服力会好一点，菌液PCR条带大也不是大问题了。
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9楼2017-06-06 00:16:46
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