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板子长不出菌啊好着急 已有3人参与
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我们实验室三个人做基因克隆，一个用的pEASY-blunt克隆载体，用的卡纳的板子，我们俩用的blunt E1表达载体，用的氨苄的板子，但是连接转化涂平板之后都长不出菌是为啥啊！昨天用质粒做了对照，质粒就长了满满一板子，说明感受态没问题啊，操作用的都是同一套，而且三个人谁做都长不出来，实在想不出来是哪里有问题啊……各位师兄师姐帮帮忙啊 发自小木虫Android客户端 |
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sherlock0088
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5楼2017-05-31 18:57:46
感谢参与，应助指数 +1
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3楼2017-05-31 12:54:02
4楼2017-05-31 14:31:45
sherlock0088
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请详细描述你克隆的过程，包括所用的体系（包括但不限于PCR体系，连接体系），克隆片段长度，产物浓度，A260/A260，A260/A230，nanodrop峰图或吸光度曲线，溶解或回收用的是什么 发自小木虫Android客户端 |
2楼2017-05-31 11:42:58
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PCR跑的是20μ升体系，我的片段长度1600bp，用的全式金的酶，然后用的生工的回收试剂盒，回收产物跑电泳，Maker点2.5μ升，条带亮度和Maker差不多，然后连接用的blunt E1载体，载体1μ升＋水1.5＋回收产物2.5μ升，PCR里25℃孵育30min，然后用的trans T1感受态，把连接产物全部加进去，冰上30min，42℃热激30s，冰上3min，加SOC，210rmp，37℃一小时，然后6000离心一分钟，留100μ升涂板子，用的氨苄的，但是好几次了，要不就是只长一两个菌，还是假阳性，要不就是一个都不长…和我一起的两个同学，我们做的基因不同，操作一样，也是不长菌…感受态用质粒做过对照，质粒长了满满一板子…好绝望啊… 发自小木虫Android客户端 |
6楼2017-06-01 10:39:09
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但是我们实在不知道为啥会连接不成功啊…都是按着说明书上和师姐教的操作的，看了好多次不长菌的板子了，心态都要崩了…我还有七个基因的原核要做，还要复习考研，真的是有点焦啊… 发自小木虫Android客户端 |
7楼2017-06-01 10:43:36
8楼2017-06-01 10:47:19
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关键是我们每次长两三个都算多了，还很多是假阳性，我总共做7个基因，前面四五个都很正常，就这段时间，板子怎么长都没有菌，昨天我同学又做了连接，用的是4μ升回收产物1μ升载体，今天早上板子上还是什么都没长。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2017-06-01 12:01:05
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10楼2017-06-01 15:03:49
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