24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 2956  |  回复: 27

FionaD

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by bbass533 at 2017-06-01 15:03:49
看了一下你发的连接体系,感觉没问题。载体和目的片段加的量应该合适的。如果试剂没问题,不该出现这种情况。你们还有新载体不,换一支试试。
我还遇到用这个E1菌检成功,摇菌死活要不起来的情况。...

我们前前后后已经用过三盒载体了,都不行,所以应该也不是那一盒载体质量的问题……

发自小木虫Android客户端
11楼2017-06-01 16:38:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aliaaxmu2016

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.把PAGE图贴上来(酶切的,鉴定的都要),我看看;2.6000离心一分钟,高了,3000RPM足以;
12楼2017-06-01 16:40:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sherlock0088

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by FionaD at 2017-06-01 10:39:09
PCR跑的是20μ升体系,我的片段长度1600bp,用的全式金的酶,然后用的生工的回收试剂盒,回收产物跑电泳,Maker点2.5μ升,条带亮度和Maker差不多,然后连接用的blunt E1载体,载体1μ升+水1.5+回收产物2.5μ升, ...

具体用什么酶扩增的?全式金的酶多了,有平末端的,也有非平末端的

发自小木虫Android客户端
13楼2017-06-01 17:21:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sherlock0088

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by FionaD at 2017-06-01 10:39:09
PCR跑的是20μ升体系,我的片段长度1600bp,用的全式金的酶,然后用的生工的回收试剂盒,回收产物跑电泳,Maker点2.5μ升,条带亮度和Maker差不多,然后连接用的blunt E1载体,载体1μ升+水1.5+回收产物2.5μ升, ...

别跟我说你用easytaq扩增的

发自小木虫Android客户端
14楼2017-06-01 17:34:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

FionaD

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by sherlock0088 at 2017-06-01 17:21:49
具体用什么酶扩增的?全式金的酶多了,有平末端的,也有非平末端的
...

用的全式金平末端的酶,FastPfu Fly 酶

发自小木虫Android客户端
15楼2017-06-01 18:05:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sherlock0088

金虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by FionaD at 2017-06-01 18:05:09
用的全式金平末端的酶,FastPfu Fly 酶
...

可以确定抗生素没有污染吗

发自小木虫Android客户端
16楼2017-06-01 18:08:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

FionaD

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by sherlock0088 at 2017-06-01 18:08:56
可以确定抗生素没有污染吗
...

嗯,因为前面同学配过抗生素加少的,板子长出来的就是密密麻麻连成一片的白色菌落,后来我们又重配了两次,没有出现过这样的污染

发自小木虫Android客户端
17楼2017-06-01 18:46:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

FionaD

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by aliaaxmu2016 at 2017-06-01 16:40:27
1.把PAGE图贴上来(酶切的,鉴定的都要),我看看;2.6000离心一分钟,高了,3000RPM足以;

图一是PCR的电泳,图二是回收产物的检测
板子长不出菌啊好着急


板子长不出菌啊好着急-1



发自小木虫Android客户端
18楼2017-06-01 18:53:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sherlock0088

金虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by FionaD at 2017-06-01 18:46:15
嗯,因为前面同学配过抗生素加少的,板子长出来的就是密密麻麻连成一片的白色菌落,后来我们又重配了两次,没有出现过这样的污染
...

这么看,PCR没问题,回收没问题,感受态没问题,抗生素没问题,可能载体的问题。你可以换个普通的T载体,别用全式金的,TAKARA或者其他公司的。正常高保真PCR完成后,加入Taq酶72度保温30分钟,回收之后连T载体然后转化感受态。一般来说T载体转化效率挺高的。

发自小木虫Android客户端
19楼2017-06-01 19:05:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

FionaD

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
19楼: Originally posted by sherlock0088 at 2017-06-01 19:05:21
这么看,PCR没问题,回收没问题,感受态没问题,抗生素没问题,可能载体的问题。你可以换个普通的T载体,别用全式金的,TAKARA或者其他公司的。正常高保真PCR完成后,加入Taq酶72度保温30分钟,回收之后连T载体然后 ...

用T载体能做原核表达么?我现在克基因是为了做原核表达

发自小木虫Android客户端
20楼2017-06-01 19:19:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 FionaD 的主题更新
信息提示
请填处理意见