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FionaD

新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by bbass533 at 2017-06-01 15:03:49
看了一下你发的连接体系，感觉没问题。载体和目的片段加的量应该合适的。如果试剂没问题，不该出现这种情况。你们还有新载体不，换一支试试。
我还遇到用这个E1菌检成功，摇菌死活要不起来的情况。...

我们前前后后已经用过三盒载体了，都不行，所以应该也不是那一盒载体质量的问题……

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11楼2017-06-01 16:38:49
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aliaaxmu2016

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.把PAGE图贴上来（酶切的，鉴定的都要），我看看；2.6000离心一分钟，高了，3000RPM足以；
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12楼2017-06-01 16:40:27
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sherlock0088

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by FionaD at 2017-06-01 10:39:09
PCR跑的是20μ升体系，我的片段长度1600bp，用的全式金的酶，然后用的生工的回收试剂盒，回收产物跑电泳，Maker点2.5μ升，条带亮度和Maker差不多，然后连接用的blunt E1载体，载体1μ升＋水1.5＋回收产物2.5μ升， ...

具体用什么酶扩增的？全式金的酶多了，有平末端的，也有非平末端的

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13楼2017-06-01 17:21:49
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sherlock0088

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by FionaD at 2017-06-01 10:39:09
PCR跑的是20μ升体系，我的片段长度1600bp，用的全式金的酶，然后用的生工的回收试剂盒，回收产物跑电泳，Maker点2.5μ升，条带亮度和Maker差不多，然后连接用的blunt E1载体，载体1μ升＋水1.5＋回收产物2.5μ升， ...

别跟我说你用easytaq扩增的

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14楼2017-06-01 17:34:02
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FionaD

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by sherlock0088 at 2017-06-01 17:21:49
具体用什么酶扩增的？全式金的酶多了，有平末端的，也有非平末端的
...

用的全式金平末端的酶，FastPfu Fly 酶

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15楼2017-06-01 18:05:09
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sherlock0088

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by FionaD at 2017-06-01 18:05:09
用的全式金平末端的酶，FastPfu Fly 酶
...

可以确定抗生素没有污染吗

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16楼2017-06-01 18:08:56
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FionaD

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by sherlock0088 at 2017-06-01 18:08:56
可以确定抗生素没有污染吗
...

嗯，因为前面同学配过抗生素加少的，板子长出来的就是密密麻麻连成一片的白色菌落，后来我们又重配了两次，没有出现过这样的污染

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17楼2017-06-01 18:46:15
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FionaD

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by aliaaxmu2016 at 2017-06-01 16:40:27
1.把PAGE图贴上来（酶切的，鉴定的都要），我看看；2.6000离心一分钟，高了，3000RPM足以；

图一是PCR的电泳，图二是回收产物的检测
板子长不出菌啊好着急


板子长不出菌啊好着急-1



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18楼2017-06-01 18:53:53
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sherlock0088

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by FionaD at 2017-06-01 18:46:15
嗯，因为前面同学配过抗生素加少的，板子长出来的就是密密麻麻连成一片的白色菌落，后来我们又重配了两次，没有出现过这样的污染
...

这么看，PCR没问题，回收没问题，感受态没问题，抗生素没问题，可能载体的问题。你可以换个普通的T载体，别用全式金的，TAKARA或者其他公司的。正常高保真PCR完成后，加入Taq酶72度保温30分钟，回收之后连T载体然后转化感受态。一般来说T载体转化效率挺高的。

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19楼2017-06-01 19:05:21
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FionaD

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by sherlock0088 at 2017-06-01 19:05:21
这么看，PCR没问题，回收没问题，感受态没问题，抗生素没问题，可能载体的问题。你可以换个普通的T载体，别用全式金的，TAKARA或者其他公司的。正常高保真PCR完成后，加入Taq酶72度保温30分钟，回收之后连T载体然后 ...

用T载体能做原核表达么？我现在克基因是为了做原核表达

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20楼2017-06-01 19:19:54
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