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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒转化实验
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Zhibao1994

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒转化实验 已有2人参与

向各位请教下关于DNA质粒转化实验。我最近在做质粒转化实验，将老师合成的质粒转入农杆菌中。第一步是将细胞从零下八十摄氏度中取出放入冰盒中半个小时，同时预冷两个1.5ml的离心管，待细胞融化后，将细胞分装于两个离心管（离心管已标注转化的质粒名称），各100ul,第二步：加入2ul的质粒，在冰上30分钟。热击（42度，45秒)，然后冰上放2分钟。第三步：加入SOC 0.9ml，然后在37度中培养一个小时，离心10分钟，4000转每分钟。涂板（Kan，LB），37度培养隔夜观察。老是只能看到几个菌落。

@biostar2009 @youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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1楼 2017-05-08 23:50:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

贱贱JMe

木虫 (小有名气)

教导主任

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-05-11 07:48:19
你确定是使用农杆菌感受态来做的吗，按照你的描述应该是DH5α的操作步骤。如果确定是农杆菌转化，步骤是不正确的，而且农杆菌的生长需要2-3天，过夜没有很正常。
农杆菌转化步骤：
1、 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
2、液氮中冷冻1分钟。
3、37℃水浴溶化细胞。
4、 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
5、离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
6、涂板，28℃培养2-3天。
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想做一位科研好人
7楼2017-05-10 16:20:09
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风霜非暖

新虫 (初入文坛)
农杆菌应该是28度培养吧

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3楼2017-05-09 23:02:20
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HZNU2013

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-10 07:55:08
转化弄杆菌:冰置30分钟，37度1分钟液氮2分钟重复一次，冰置5分钟，加不含抗生素LB，30度摇3个小时，涂板，30度倒置培养过夜。

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5楼2017-05-10 07:53:08
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ljp7786

铜虫 (初入文坛)
农杆菌是在28度培养的。

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10楼2017-05-10 21:16:59
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Romanticman

新虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by Romanticman at 2017-05-12 20:14:14
兄弟啊，你这么搞，老板不打你就不错了转化

手快，点了，哈哈，可以参考一下
质粒转化实验



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15楼2017-05-12 20:17:36
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普通回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-10 07:54:43
换感受态试试，另外长的几个菌落是不是阳性菌落呢？如果是倒也不必纠结
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2楼2017-05-09 15:10:52
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Zhibao1994

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2017-05-09 15:10:52
换感受态试试，另外长的几个菌落是不是阳性菌落呢？如果是倒也不必纠结

pMK_ppvtmv质粒转到Dh5a细胞有，但前天做的几个质粒却没有

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4楼2017-05-10 06:27:37
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Zhibao1994

新虫 (小有名气)
是说感受态细胞的问题吗？做感受态细胞时没有液氮，所以就用零下80度条件下做的

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6楼2017-05-10 08:18:09
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Zhibao1994

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 贱贱JMe at 2017-05-10 16:20:09
你确定是使用农杆菌感受态来做的吗，按照你的描述应该是DH5α的操作步骤。如果确定是农杆菌转化，步骤是不正确的，而且农杆菌的生长需要2-3天，过夜没有很正常。
农杆菌转化步骤：
1、 加1ug DNA于200ul感受态细胞 ...

谢谢。

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8楼2017-05-10 18:21:59
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白夜07


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9楼2017-05-10 19:07:14
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