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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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Zhibao1994

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

[求助] 质粒转化实验 已有2人参与

向各位请教下关于DNA质粒转化实验。我最近在做质粒转化实验,将老师合成的质粒转入农杆菌中。第一步是将细胞从零下八十摄氏度中取出放入冰盒中半个小时,同时预冷两个1.5ml的离心管,待细胞融化后,将细胞分装于两个离心管(离心管已标注转化的质粒名称),各100ul,第二步:加入2ul的质粒,在冰上30分钟。热击(42度,45秒),然后冰上放2分钟。第三步:加入SOC 0.9ml,然后在37度中培养一个小时,离心10分钟,4000转每分钟。涂板(Kan,LB),37度培养隔夜观察。老是只能看到几个菌落。

@biostar2009 @youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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贱贱JMe

专家顾问

教导主任

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-05-11 07:48:19
你确定是使用农杆菌感受态来做的吗,按照你的描述应该是DH5α的操作步骤。如果确定是农杆菌转化,步骤是不正确的,而且农杆菌的生长需要2-3天,过夜没有很正常。
农杆菌转化步骤:
1、 加1ug DNA于200ul感受态细胞中,冰上放置30分钟。
2、液氮中冷冻1分钟。
3、37℃水浴溶化细胞。
4、 加1ml YEP培养基,28℃摇床培养2-4hr(低速)。
5、离心1分钟,悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
6、涂板,28℃培养2-3天。
想做一位科研好人
7楼2017-05-10 16:20:09
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风霜非暖

管理员

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3楼2017-05-09 23:02:20
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HZNU2013

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!



西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-10 07:55:08
转化弄杆菌:冰置30分钟,37度1分钟液氮2分钟重复一次,冰置5分钟,加不含抗生素LB,30度摇3个小时,涂板,30度倒置培养过夜。

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5楼2017-05-10 07:53:08
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ljp7786

专家顾问

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10楼2017-05-10 21:16:59
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Romanticman

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
14楼: Originally posted by Romanticman at 2017-05-12 20:14:14
兄弟啊,你这么搞,老板不打你就不错了转化

手快,点了,哈哈,可以参考一下
质粒转化实验



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15楼2017-05-12 20:17:36
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普通回帖

stone2239

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-10 07:54:43
换感受态试试,另外长的几个菌落是不是阳性菌落呢?如果是倒也不必纠结
2楼2017-05-09 15:10:52
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Zhibao1994

实习版主

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引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2017-05-09 15:10:52
换感受态试试,另外长的几个菌落是不是阳性菌落呢?如果是倒也不必纠结

pMK_ppvtmv质粒转到Dh5a细胞有,但前天做的几个质粒却没有

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4楼2017-05-10 06:27:37
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Zhibao1994

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

是说感受态细胞的问题吗?做感受态细胞时没有液氮,所以就用零下80度条件下做的

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6楼2017-05-10 08:18:09
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Zhibao1994

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
7楼: Originally posted by 贱贱JMe at 2017-05-10 16:20:09
你确定是使用农杆菌感受态来做的吗,按照你的描述应该是DH5α的操作步骤。如果确定是农杆菌转化,步骤是不正确的,而且农杆菌的生长需要2-3天,过夜没有很正常。
农杆菌转化步骤:
1、 加1ug DNA于200ul感受态细胞 ...

谢谢。

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8楼2017-05-10 18:21:59
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白夜07

超级版主

9楼2017-05-10 19:07:14
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