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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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cutepigxia

新虫 (正式写手)

[求助] 求助蓝白斑筛选的相关问题 已有1人参与

我涂的板为什么会培养基都变蓝色,而且也没有多少白菌,挑一两个看似白菌的菌落再划线到新制的含氨变青霉素,x-gal,IPTG的平板上结果都又是蓝色,想知道是什么原因,有木有人能给解释一下,谢谢!

求助蓝白斑筛选的相关问题


求助蓝白斑筛选的相关问题-1


求助蓝白斑筛选的相关问题-2


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木虫 (著名写手)

涂布技术不过关,或者平板没晾干,或者涂太多,或者没有涂开,或者涂了没有吹干没有倒置平放。
为什么
17楼2017-04-19 11:32:49
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

蓝白斑的原理是α互补。JM109的LacZ基因缺少α片段,因此,不能分解x-gal显蓝色。质粒载体上有完整的α基因序列,多克隆位点也在这段序列内

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3楼2017-04-18 11:45:33
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

如果在这个位点插入了外源片段,将会破坏α阅读框,这种破坏大部分情况下会造成α基因失活。如果没有插入外源基因,α片段就可以表达,使得基因LacZ组装完整,分解x-gal显蓝色

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4楼2017-04-18 11:49:09
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

出现大片的蓝斑,一是可能根本没连上外源片段,全是自连接。二是插入的片段未能使α基因失活,虽然正确插入了,却依然是显蓝斑,这种情况一般常见于插入片段小于500bp,但是也有报道插入2000bp也依然无法失活α片段,显蓝色。

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5楼2017-04-18 11:52:48
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

第三种,就是你用了LacZ基因完整的菌株,例如BL21,MG1655。这些菌株的LacZ基因是完整的,只要有诱导剂和显色剂,就会显蓝色

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6楼2017-04-18 11:54:45
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

排除第三种,直接把菌株涂布在IPTG和x-gal上,看是否显色

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7楼2017-04-18 11:55:45
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

排除第一种,直接不要加片段,转化空载体,看是不是因为载体自连接效率太高导致的。

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8楼2017-04-18 11:56:48
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

排除第二种,直接用通用引物做一下菌落pcr,跑胶看一下大小就行了

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9楼2017-04-18 11:57:43
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

看你的平板长得这么浓密,载体根本没切开的可能性最高。换新酶,切一下就好了。切完跑一下胶,单条带才对。没切开的环状质粒至少有两条带。

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10楼2017-04-18 11:59:39
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

还有,你的平板那么集中,涂板也没涂开

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11楼2017-04-18 12:00:53
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

蓝色集中,可能是在平板上涂布的x-gal,应该在倒板时,待培养基不烫手时,加amp,IPTG,x-gal,混匀后倒板,才会均一。另外貌似x-gal加多了,再确认一下浓度。

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12楼2017-04-18 12:04:05
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普通回帖

小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)

用JM109菌株,不要用BL21或者MG1655

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2楼2017-04-18 10:56:52
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