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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助PCR以前能出条带现在却没有了
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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risic

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[求助] 求助PCR以前能出条带现在却没有了 已有1人参与

大四作为毕设，时间没多少了，pcr又出问题，求各位大神帮忙了！

1.一开始是用老师提的基因组为模板，做了很多次都有条带；

2.后来老师提的基因组快用完了，我就自己提了基因组（模板浓度稀释到和之前一样），做50ul*5的大体系，大孔全部上样，条带很浅，曝光才能看到

3.为了优化，我又做了25ul的小体系，模板浓度加倍、减半，又设置了4个梯度退火温度，一共六管样品，10ul上样全无条带！只有很亮的引物二聚体。

4.今天又试了一次，把之前老师提的基因组剩下的一点点拿来做阳性对照，结果也没有条带

自己想法：
1.所以反应体系和反应温度都没有改变，唯一记得有不同的是3和4用的taq酶是没有加甘油的，我有查到甘油会影响特异性，不过现在不是杂带的问题而是不出条带的问题。
2.如果说是操作中的偶然失误的话，我不至于做了那么多管一管都没出条带吧
3.还有大体系有条带怎么小体系就没有了？
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1楼 2017-04-13 17:22:32
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lusandanooo

专家顾问

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
risic: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢换了酶能出条带了 2017-04-14 22:35:37
跟甘油关系不大，公司有的预混buffer里都自带甘油，一样能P出来。你确定你的程序没问题？我有一次好久没做PCR把程序退火设成3min了，啥都没P出来。尝试把退火温度降低试一下，或者换个酶，不知道片段多大，如果片段长，TAKARA的primer star挺好用的，或者换个其他热启动酶试试。
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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
6楼2017-04-14 14:59:02
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yesucao

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引物存放多久了，重新干粉溶解一管再试试

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4楼2017-04-13 23:08:43
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小飞侠侠侠

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
你的引物是不是没有设计好啊？

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2楼2017-04-13 18:13:11
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lusandanooo

超级版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引物负20放几个月都没事的
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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
7楼2017-04-14 15:01:01
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lusandanooo

版主

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8楼: Originally posted by risic at 2017-04-14 15:18:42
程序应该没问题，这几天我都只做这个没变过。最诡异的就是我12号那天上午做大体系有条带，下午小体系就没条带了。谢谢我试试换个酶...

换体系P不出来挺正常的，有时候多加点水都P不出来。
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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
10楼2017-04-14 15:50:33
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普通回帖

risic

超级版主

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2楼: Originally posted by 小飞侠侠侠 at 2017-04-13 18:13:11
你的引物是不是没有设计好啊？

引物确实比较一般，因为模板序列对称互补的不好设计，不过之前也能正常p出来呀
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3楼2017-04-13 19:04:23
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risic

管理员

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4楼: Originally posted by yesucao at 2017-04-13 23:08:43
引物存放多久了，重新干粉溶解一管再试试

引物存放是快一个月了，不过1是9号做了一次，大体系有亮条带；2和3都是是昨天做的，上午做的大体系有暗条带，下午完全做的小体系就没条带了。时间间隔那么短回收引物的问题么？
干粉的话得重新定，过几天在试试看
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5楼2017-04-13 23:38:26
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risic

管理员

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引用回帖:
6楼: Originally posted by lusandanooo at 2017-04-14 14:59:02
跟甘油关系不大，公司有的预混buffer里都自带甘油，一样能P出来。你确定你的程序没问题？我有一次好久没做PCR把程序退火设成3min了，啥都没P出来。尝试把退火温度降低试一下，或者换个酶，不知道片段多大，如果片段 ...

程序应该没问题，这几天我都只做这个没变过。最诡异的就是我12号那天上午做大体系有条带，下午小体系就没条带了。谢谢我试试换个酶
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8楼2017-04-14 15:18:42
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risic

兑换贵宾

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7楼: Originally posted by lusandanooo at 2017-04-14 15:01:01
引物负20放几个月都没事的

那请问多次冻融会影响引物质量么
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9楼2017-04-14 15:34:16
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