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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助PCR以前能出条带现在却没有了
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risic

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助PCR以前能出条带现在却没有了 已有1人参与

大四作为毕设，时间没多少了，pcr又出问题，求各位大神帮忙了！

1.一开始是用老师提的基因组为模板，做了很多次都有条带；

2.后来老师提的基因组快用完了，我就自己提了基因组（模板浓度稀释到和之前一样），做50ul*5的大体系，大孔全部上样，条带很浅，曝光才能看到

3.为了优化，我又做了25ul的小体系，模板浓度加倍、减半，又设置了4个梯度退火温度，一共六管样品，10ul上样全无条带！只有很亮的引物二聚体。

4.今天又试了一次，把之前老师提的基因组剩下的一点点拿来做阳性对照，结果也没有条带

自己想法：
1.所以反应体系和反应温度都没有改变，唯一记得有不同的是3和4用的taq酶是没有加甘油的，我有查到甘油会影响特异性，不过现在不是杂带的问题而是不出条带的问题。
2.如果说是操作中的偶然失误的话，我不至于做了那么多管一管都没出条带吧
3.还有大体系有条带怎么小体系就没有了？
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1楼 2017-04-13 17:22:32
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risic

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小飞侠侠侠 at 2017-04-13 18:13:11
你的引物是不是没有设计好啊？

引物确实比较一般，因为模板序列对称互补的不好设计，不过之前也能正常p出来呀
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3楼2017-04-13 19:04:23
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小飞侠侠侠

新虫 (初入文坛)
你的引物是不是没有设计好啊？

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2楼2017-04-13 18:13:11
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yesucao

木虫 (正式写手)
引物存放多久了，重新干粉溶解一管再试试

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4楼2017-04-13 23:08:43
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risic

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yesucao at 2017-04-13 23:08:43
引物存放多久了，重新干粉溶解一管再试试

引物存放是快一个月了，不过1是9号做了一次，大体系有亮条带；2和3都是是昨天做的，上午做的大体系有暗条带，下午完全做的小体系就没条带了。时间间隔那么短回收引物的问题么？
干粉的话得重新定，过几天在试试看
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5楼2017-04-13 23:38:26
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