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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 【求助】Ni亲和层析 杂蛋白与目的蛋白一同被洗脱
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lff20126206

新虫 (小有名气)

[求助] 【求助】Ni亲和层析 杂蛋白与目的蛋白一同被洗脱 已有2人参与

如题，用BL21表达蛋白，大小120KD，预测等电点为5.68。（PS：我扫描胶的效果不好，但能说明问题就行了）
细胞破碎液过镍柱后洗杂蛋白，并用含咪唑（50,100,150, 200, 300, 500mM）的咪唑洗脱液洗脱，总是有杂蛋白在洗脱液里。图中beas就是镍柱，表明我的蛋白是挂在镍柱上了。（PS：不知道为什么，诱导前后看不到我的目的蛋白表达量升高，之前小量诱导的时候，确定该蛋白能被诱导。）
尝试了用500mMNaCl洗脱（不含咪唑）杂蛋白，发洗脱中的杂带并未改善。
请教各位大侠，有什么办法可以解决这个问题？

【求助】Ni亲和层析 杂蛋白与目的蛋白一同被洗脱
图片1.png@gyesang@hc-material
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1楼 2017-04-13 14:41:56
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lff20126206

新虫 (小有名气)
好的，多谢指点，之前还考虑过完镍柱再过分子筛，因为我的蛋白比较大，杂带都在下面

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10楼2017-04-14 08:11:16
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eggplant1993

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
50mM咪唑目的蛋白就洗脱下来了，可以考虑先用更低的咪唑梯度洗脱杂蛋白或者在破碎细胞液里加低浓度咪唑（5-20mM）减少镍柱非特异性吸附。后面咪唑梯度洗脱不要那么细减少目的蛋白损失，再考虑用离子交换看能否去除杂蛋白。

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15楼2017-04-15 22:48:35
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普通回帖

lff20126206

新虫 (小有名气)
请大神们帮帮我啊，悬赏金币啊！
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2楼2017-04-13 14:45:10
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lff20126206

新虫 (小有名气)
顶上去，谢谢大家
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3楼2017-04-13 17:15:59
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lff20126206

新虫 (小有名气)
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4楼2017-04-13 17:16:28
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匿名
本帖仅楼主可见
5楼2017-04-13 17:36:34
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学习达人123

铁虫 (初入文坛)
我的蛋白也是这样，蛋白又少条带又杂，跪求答案

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6楼2017-04-13 21:46:43
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
再过个离子交换吧，镍柱纯化效果没有想象的那么高，除非你的蛋白表达量超高，否则还是要进一步纯化的
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7楼2017-04-13 23:05:29
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lff20126206

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-04-13 23:05:29
再过个离子交换吧，镍柱纯化效果没有想象的那么高，除非你的蛋白表达量超高，否则还是要进一步纯化的

请问大神，建议是先过离子柱还是先过镍柱呢？
多谢多谢~

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8楼2017-04-14 07:57:57
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lff20126206 at 2017-04-14 07:57:57
请问大神，建议是先过离子柱还是先过镍柱呢？
多谢多谢~
...

先过镍柱，再过离子交换。记得过完镍柱把蛋白浓缩一下顺便换一下缓冲液除去咪唑
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9楼2017-04-14 08:08:50
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