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lff20126206新虫 (小有名气)
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【求助】Ni亲和层析 杂蛋白与目的蛋白一同被洗脱 已有2人参与
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如题，用BL21表达蛋白，大小120KD，预测等电点为5.68。（PS：我扫描胶的效果不好，但能说明问题就行了） 细胞破碎液过镍柱后洗杂蛋白，并用含咪唑（50,100,150, 200, 300, 500mM）的咪唑洗脱液洗脱，总是有杂蛋白在洗脱液里。图中beas就是镍柱，表明我的蛋白是挂在镍柱上了。（PS：不知道为什么，诱导前后看不到我的目的蛋白表达量升高，之前小量诱导的时候，确定该蛋白能被诱导。） 尝试了用500mMNaCl洗脱（不含咪唑）杂蛋白，发洗脱中的杂带并未改善。 请教各位大侠，有什么办法可以解决这个问题？  图片1.png@gyesang@hc-material |
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lff20126206
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10楼2017-04-14 08:11:16
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【答案】应助回帖
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50mM咪唑目的蛋白就洗脱下来了，可以考虑先用更低的咪唑梯度洗脱杂蛋白或者在破碎细胞液里加低浓度咪唑（5-20mM）减少镍柱非特异性吸附。后面咪唑梯度洗脱不要那么细减少目的蛋白损失，再考虑用离子交换看能否去除杂蛋白。 发自小木虫Android客户端 |
15楼2017-04-15 22:48:35
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5楼2017-04-13 17:36:34
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9楼2017-04-14 08:08:50
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