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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 【求助】Ni亲和层析 杂蛋白与目的蛋白一同被洗脱
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lff20126206

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-04-14 08:08:50
先过镍柱，再过离子交换。记得过完镍柱把蛋白浓缩一下顺便换一下缓冲液除去咪唑...

好的，多谢指点，之前还考虑过完镍柱再过分子筛，因为我的蛋白比较大，杂带都在下面

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11楼2017-04-14 08:11:43
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Silence_D

新虫 (初入文坛)
表达量低，而且还大部分在包涵体...可尝试优化上清表达

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12楼2017-04-14 17:24:27
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lff20126206

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by Silence_D at 2017-04-14 17:24:27
表达量低，而且还大部分在包涵体...可尝试优化上清表达

好的，多谢啦，我是16度诱导过夜了，诱导应该没问题。至于表达在沉淀中，我觉得只要上清中的够用就可以了，当然还得优化超声破碎的过程，多谢啦

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13楼2017-04-15 16:21:21
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wuhu0612331

铜虫 (正式写手)
首先120kd蛋白在大肠杆菌里表达本来就有难度，表达量低是肯定的，按照市面上镍柱的吸附能力一般都能达到1ml20mg以上，当你的目的蛋白减少时，其他杂蛋白和柱子的非特异性结合也随着增高，可以多表达一些，按比例少用点柱料，裂解液里加10mm咪唑试试。可以参考一下。

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14楼2017-04-15 16:37:19
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eggplant1993

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
50mM咪唑目的蛋白就洗脱下来了，可以考虑先用更低的咪唑梯度洗脱杂蛋白或者在破碎细胞液里加低浓度咪唑（5-20mM）减少镍柱非特异性吸附。后面咪唑梯度洗脱不要那么细减少目的蛋白损失，再考虑用离子交换看能否去除杂蛋白。

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15楼2017-04-15 22:48:35
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)
镍柱纯化效果没有理想中那么好，一般后续还要跟离子柱和分子筛。镍柱一般都是高盐上样，减少特异性吸附。接离子柱的时候电导尽量稀释到低一些。

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16楼2017-04-15 23:07:55
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lff20126206

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by wuhu0612331 at 2017-04-15 16:37:19
首先120kd蛋白在大肠杆菌里表达本来就有难度，表达量低是肯定的，按照市面上镍柱的吸附能力一般都能达到1ml20mg以上，当你的目的蛋白减少时，其他杂蛋白和柱子的非特异性结合也随着增高，可以多表达一些，按比例少用 ...

挺好的建议，我的裂解液里一直有10mm咪唑。下次我试试摇上2升菌，用800微升镍柱去结合。

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17楼2017-04-15 23:55:15
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lff20126206

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by eggplant1993 at 2017-04-15 22:48:35
50mM咪唑目的蛋白就洗脱下来了，可以考虑先用更低的咪唑梯度洗脱杂蛋白或者在破碎细胞液里加低浓度咪唑（5-20mM）减少镍柱非特异性吸附。后面咪唑梯度洗脱不要那么细减少目的蛋白损失，再考虑用离子交换看能否去除杂 ...

是啊，我的目的蛋白损失太多了，好可惜，谢谢你的建议

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18楼2017-04-15 23:56:11
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lff20126206

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2017-04-15 23:07:55
镍柱纯化效果没有理想中那么好，一般后续还要跟离子柱和分子筛。镍柱一般都是高盐上样，减少特异性吸附。接离子柱的时候电导尽量稀释到低一些。

请问大神，建议我后面是跟着离子柱还是分子筛呢？我有点纠结。

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19楼2017-04-15 23:57:20
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酶学相关

新虫 (初入文坛)
为什么不先预处理除杂蛋白，再做酸碱处理除杂蛋白，再做浓缩除杂蛋白提高浓度，再过离交树脂？？

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20楼2017-04-16 16:27:47
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