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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 急求助，融合PCR融合不出的问题
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piggyflym

金虫 (正式写手)

[求助] 急求助，融合PCR融合不出的问题 已有1人参与

同源敲除，左臂1000bp左右，右臂850bp，抗性片段2100bp。左臂的下游引物与抗性片段上游引物；右臂的上游引物与抗性片段的下游引物有互补部分。

用的Es Taq酶，摩尔比 左臂：抗性片段：右臂=1：3：1，20μl体系

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30cycle

第一次碰上融合不上的情况，求大神
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1楼 2017-03-09 04:43:42
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badronger

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-10 07:40:56
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的，不知道你是怎么确定的，然后融合是需要两步pcr的，第一步不添加引物，循环十几次，第二次pcr 只添加引物，再循环30左右，而且50微升体系会不会好一点，我是一直用50的，是为了胶回收浓度大一点。

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2楼2017-03-09 09:19:57
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piggyflym

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by badronger at 2017-03-09 09:19:57
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的，不知道你是怎么确定的，然后融合是需要两步pcr的，第一步不添加引物，循环十几次，第二次pcr 只添加引物，再循环30左右，而且50微升体系会不会好一点，我是一直用50的，是为 ...

我们以前都是第一轮直接融合，不加引物，融合出目的片段后，第一轮产物稀释约50倍，然后以稀释产物为模板，加引物进行第二轮pcr，之后胶回收纯化。

现在就是第一轮融合不出来= =  请问你们的片段添加比例是怎么计算的麻烦了
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3楼2017-03-09 15:32:16
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piggyflym

金虫 (正式写手)
4楼2017-03-10 04:01:58
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piggyflym

金虫 (正式写手)
有没有大神能指点一下，同时敲7个，只融合上了一个
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5楼2017-03-11 03:10:03
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萌萌笑笑

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by piggyflym at 2017-03-09 15:32:16
我们以前都是第一轮直接融合，不加引物，融合出目的片段后，第一轮产物稀释约50倍，然后以稀释产物为模板，加引物进行第二轮pcr，之后胶回收纯化。

现在就是第一轮融合不出来= =  请问你们的片段添加比例是怎么 ...

您好！最近在做融合PCR，目前已经得到待融合片段，但不知道接下来该如何设置反应的体系和PCR程序，希望可以得到您的指导，谢谢啦 ！
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要想活得精彩必须加倍努力。
6楼2017-03-25 16:28:13
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萌萌笑笑

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by badronger at 2017-03-09 09:19:57
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的，不知道你是怎么确定的，然后融合是需要两步pcr的，第一步不添加引物，循环十几次，第二次pcr 只添加引物，再循环30左右，而且50微升体系会不会好一点，我是一直用50的，是为 ...

您好！最近在做融合PCR，目前已经得到待融合片段，但不知道接下来该如何设置反应的体系和PCR程序，希望可以得到您的指导，谢谢啦 ！
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要想活得精彩必须加倍努力。
7楼2017-03-25 16:28:31
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Davan2464

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by badronger at 2017-03-09 09:19:57
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的，不知道你是怎么确定的，然后融合是需要两步pcr的，第一步不添加引物，循环十几次，第二次pcr 只添加引物，再循环30左右，而且50微升体系会不会好一点，我是一直用50的，是为 ...

最近再做融合PCR，之前都是直接加印物进行融合的，但是最近换了新基因新引物，现在融合不上了。请问你的第一轮的PCR体系是多少？具体的温度程序是什么？和普通的PCR反应就只是引物的差别吗
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8楼2017-05-19 12:22:05
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