应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 急求助，融合PCR融合不出的问题
81/1返回列表
查看: 7104  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

piggyflym

金虫 (正式写手)

[求助] 急求助，融合PCR融合不出的问题 已有1人参与

同源敲除，左臂1000bp左右，右臂850bp，抗性片段2100bp。左臂的下游引物与抗性片段上游引物；右臂的上游引物与抗性片段的下游引物有互补部分。

用的Es Taq酶，摩尔比 左臂：抗性片段：右臂=1：3：1，20μl体系

94℃  5min
94℃   30s
58℃  30s
72℃   2min10s

30cycle

第一次碰上融合不上的情况，求大神
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-03-09 04:43:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

badronger

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-10 07:40:56
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的，不知道你是怎么确定的，然后融合是需要两步pcr的，第一步不添加引物，循环十几次，第二次pcr 只添加引物，再循环30左右，而且50微升体系会不会好一点，我是一直用50的，是为了胶回收浓度大一点。

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2017-03-09 09:19:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

piggyflym

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by badronger at 2017-03-09 09:19:57
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的，不知道你是怎么确定的，然后融合是需要两步pcr的，第一步不添加引物，循环十几次，第二次pcr 只添加引物，再循环30左右，而且50微升体系会不会好一点，我是一直用50的，是为 ...

我们以前都是第一轮直接融合，不加引物，融合出目的片段后，第一轮产物稀释约50倍，然后以稀释产物为模板，加引物进行第二轮pcr，之后胶回收纯化。

现在就是第一轮融合不出来= =  请问你们的片段添加比例是怎么计算的麻烦了
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2017-03-09 15:32:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

piggyflym

金虫 (正式写手)
4楼2017-03-10 04:01:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

piggyflym

金虫 (正式写手)
有没有大神能指点一下，同时敲7个，只融合上了一个
赞一下 回复此楼
5楼2017-03-11 03:10:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萌萌笑笑

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by piggyflym at 2017-03-09 15:32:16
我们以前都是第一轮直接融合，不加引物，融合出目的片段后，第一轮产物稀释约50倍，然后以稀释产物为模板，加引物进行第二轮pcr，之后胶回收纯化。

现在就是第一轮融合不出来= =  请问你们的片段添加比例是怎么 ...

您好！最近在做融合PCR，目前已经得到待融合片段，但不知道接下来该如何设置反应的体系和PCR程序，希望可以得到您的指导，谢谢啦 ！
赞一下 回复此楼
要想活得精彩必须加倍努力。
6楼2017-03-25 16:28:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萌萌笑笑

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by badronger at 2017-03-09 09:19:57
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的，不知道你是怎么确定的，然后融合是需要两步pcr的，第一步不添加引物，循环十几次，第二次pcr 只添加引物，再循环30左右，而且50微升体系会不会好一点，我是一直用50的，是为 ...

您好！最近在做融合PCR，目前已经得到待融合片段，但不知道接下来该如何设置反应的体系和PCR程序，希望可以得到您的指导，谢谢啦 ！
赞一下 回复此楼
要想活得精彩必须加倍努力。
7楼2017-03-25 16:28:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Davan2464

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by badronger at 2017-03-09 09:19:57
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的，不知道你是怎么确定的，然后融合是需要两步pcr的，第一步不添加引物，循环十几次，第二次pcr 只添加引物，再循环30左右，而且50微升体系会不会好一点，我是一直用50的，是为 ...

最近再做融合PCR，之前都是直接加印物进行融合的，但是最近换了新基因新引物，现在融合不上了。请问你的第一轮的PCR体系是多少？具体的温度程序是什么？和普通的PCR反应就只是引物的差别吗
赞一下 回复此楼
8楼2017-05-19 12:22:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 piggyflym 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +31 医学老男孩 2026-08-13 69/3450 2026-08-16 00:16 by mo_mo_mo_mo
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +12 archvillain 2026-08-15 23/1150 2026-08-15 20:47 by foyo404
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +7 Ldrop2023 2026-08-13 7/350 2026-08-15 15:57 by mzhh2000
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +10 majunge000 2026-08-10 13/650 2026-08-15 12:26 by hanpeng972
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 22/1100 2026-08-14 23:45 by Noways
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭