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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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piggyflym

金虫 (正式写手)

[求助] 急求助,融合PCR融合不出的问题 已有1人参与

同源敲除,左臂1000bp左右,右臂850bp,抗性片段2100bp。左臂的下游引物与抗性片段上游引物;右臂的上游引物与抗性片段的下游引物有互补部分。

用的Es Taq酶,摩尔比 左臂:抗性片段:右臂=1:3:1,20μl体系

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30cycle

第一次碰上融合不上的情况,求大神
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萌萌笑笑

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by badronger at 2017-03-09 09:19:57
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的,不知道你是怎么确定的,然后融合是需要两步pcr的,第一步不添加引物,循环十几次,第二次pcr 只添加引物,再循环30左右,而且50微升体系会不会好一点,我是一直用50的,是为 ...

您好!最近在做融合PCR,目前已经得到待融合片段,但不知道接下来该如何设置反应的体系和PCR程序,希望可以得到您的指导,谢谢啦 !
要想活得精彩必须加倍努力。
7楼2017-03-25 16:28:31
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badronger

新虫 (初入文坛)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-10 07:40:56
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的,不知道你是怎么确定的,然后融合是需要两步pcr的,第一步不添加引物,循环十几次,第二次pcr 只添加引物,再循环30左右,而且50微升体系会不会好一点,我是一直用50的,是为了胶回收浓度大一点。

发自小木虫IOS客户端
2楼2017-03-09 09:19:57
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piggyflym

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by badronger at 2017-03-09 09:19:57
三个片段的添加比例是根据摩尔浓度来的,不知道你是怎么确定的,然后融合是需要两步pcr的,第一步不添加引物,循环十几次,第二次pcr 只添加引物,再循环30左右,而且50微升体系会不会好一点,我是一直用50的,是为 ...

我们以前都是第一轮直接融合,不加引物,融合出目的片段后,第一轮产物稀释约50倍,然后以稀释产物为模板,加引物进行第二轮pcr,之后胶回收纯化。

现在就是第一轮融合不出来= =  请问你们的片段添加比例是怎么计算的麻烦了
3楼2017-03-09 15:32:16
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piggyflym

金虫 (正式写手)

有没有大神能指点一下,同时敲7个,只融合上了一个
5楼2017-03-11 03:10:03
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