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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 医学 » 检验 » elisa反应异常
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ywc193x

金虫 (正式写手)

[求助] elisa反应异常 已有5人参与

大家好，最近做实验有如下现象，麻烦各位解惑！
            
       实验一： 我做elisa实验，包被蛋白A，用抗A的鼠单抗与之反应，再用酶标二抗反应，最后显色，证明蛋白A和抗A抗体能反应；

       实验二：我包被蛋白A，用蛋白A（3个浓度梯度，最高的和包被浓度一样）和抗A的鼠单抗一同加入到微孔中反应，再用酶标二抗反应，最后显色，结果发现没发生竞争反应，不知道原因？？

       实验三：我更换反应buffer（5.0、6.0、7.4、8.5、9.0），重复实验二，结果也是一样不发生竞争反应。
         
       请问各位有没有碰到同样的情况，怎么解决啊？？
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爱生活爱自己
1楼 2017-02-21 16:12:07
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ledah

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ywc193x: 金币+6, ★★★很有帮助 2017-02-28 10:19:56
我觉得你的一抗还是比较高，你可以试试包被一抗，用蛋白A孵育结合30min，再加二抗显色，对比看一下蛋白A有没有起到遮挡一抗的作用。。再有就是，完整抗体一般是二价的，你这个竞争实验可以先让一抗和蛋白A在无蛋白包被的封闭板中孵育10min再转入包被板中试试。
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6楼2017-02-22 17:09:46
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夏滋味8858

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是还要摸条件呢，间接ELISA和竞争ELISA条件应该不同要再摸吧，你的对照呢？是怎么设置的
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2楼2017-02-21 22:27:54
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ywc193x

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏滋味8858 at 2017-02-21 22:27:54
是不是还要摸条件呢，间接ELISA和竞争ELISA条件应该不同要再摸吧，你的对照呢？是怎么设置的

我调整了，一点竞争也没有，比较奇怪（一抗浓度不高，显色1.0）
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爱生活爱自己
3楼2017-02-22 09:08:24
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258804873

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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ywc193x: 金币+6 2017-02-28 10:25:03
首先要摸索包被蛋白、一抗和二抗的最佳工作浓度，浓度过高会遮蔽竞争。
其次，需要对照试验，包括二抗对包被蛋白的结合检测，已确保二抗对包被蛋白没有交叉反应。
还有一个疑问就是，没有封闭蛋白？？？如有封闭蛋白，同样需要检测一抗和二抗对其的交叉反应
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7楼2017-02-24 14:25:01
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

竞争法的基础：限量抗体。只有在限量抗体基础上，两抗原才会形成竞争关系。所以你的这种情况，在步骤无误的情况下，还是建议把抗体的量减少，或者你拉开抗体梯度做几个孔看看。
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10楼2017-02-28 16:25:28
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普通回帖

深山在我家

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
4楼2017-02-22 09:20:48
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ywc193x

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏滋味8858 at 2017-02-21 22:27:54
是不是还要摸条件呢，间接ELISA和竞争ELISA条件应该不同要再摸吧，你的对照呢？是怎么设置的

我调整了，一点竞争也没有，比较奇怪（一抗浓度不高，显色1.0）
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5楼2017-02-22 11:07:30
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ywc193x

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ledah at 2017-02-22 17:09:46
我觉得你的一抗还是比较高，你可以试试包被一抗，用蛋白A孵育结合30min，再加二抗显色，对比看一下蛋白A有没有起到遮挡一抗的作用。。再有就是，完整抗体一般是二价的，你这个竞争实验可以先让一抗和蛋白A在无蛋白包 ...

谢谢您的回复！
首先：（我觉得你的一抗还是比较高，你可以试试包被一抗，用蛋白A孵育结合30min，再加二抗显色，对比看一下蛋白A有没有起到遮挡一抗的作用）二抗的结合位点和蛋白的结合位点不一样，这个能遮蔽吗？

（完整抗体一般是二价的，你这个竞争实验可以先让一抗和蛋白A在无蛋白包被的封闭板中孵育10min再转入包被板中试试。）抗体是二价的，但游离的蛋白比包被在膜上的蛋白更容易和抗体反应啊，这么高的游离蛋白都不发生竞争反应应该不是这个原有把
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爱生活爱自己
8楼2017-02-28 10:24:50
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ywc193x

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 258804873 at 2017-02-24 14:25:01
首先要摸索包被蛋白、一抗和二抗的最佳工作浓度，浓度过高会遮蔽竞争。
其次，需要对照试验，包括二抗对包被蛋白的结合检测，已确保二抗对包被蛋白没有交叉反应。
还有一个疑问就是，没有封闭蛋白？？？如有封闭蛋 ...

首先，包被蛋白、一抗和二抗的最佳工作浓度是优化过的
其次，都设置了对照实验，没非特异性反应
用3%BSA封闭过的
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爱生活爱自己
9楼2017-02-28 10:27:46
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