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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于诱导表达问题
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
上清过柱了吗？如果过了可以再过一次。得到纯化的蛋白是最终目标

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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
11楼2017-02-15 09:18:25
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新人求帮助

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by drwhoknowss at 2017-02-15 09:18:25
上清过柱了吗？如果过了可以再过一次。得到纯化的蛋白是最终目标

还没有，我现在还没做纯化，跑蛋白胶的目的是想看看表达量如何，结果发现上清蛋白太少了，所以就想问问是什么原因导致的

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12楼2017-02-15 09:26:43
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 新人求帮助 at 2017-02-15 09:26:43
还没有，我现在还没做纯化，跑蛋白胶的目的是想看看表达量如何，结果发现上清蛋白太少了，所以就想问问是什么原因导致的
...

不上柱其实没多少，毕竟不能超过本身蛋白太多。先过柱再说，纯化过后有才是真有

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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
13楼2017-02-15 10:15:47
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栾栾silence

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-02-16 07:48:27
引用回帖:
4楼: Originally posted by 新人求帮助 at 2017-02-14 16:45:35
超声时间过长不是会使蛋白变性吗？这样不会影响酶活性的测定吗...

超声时间过长会产生很多杂蛋白，而且可能会使目的蛋白破碎，所以所有的事情都不可能两全其美的，你可以把超声时间调成超1s，停1s（共15min，超2遍）。如果还是担心变性之类的，还是采用包涵体的方式提纯蛋白吧。
我表达的蛋白也会大多都在沉淀里，如果上清中有一些，我就不管沉淀，就提上清中的蛋白就好了，这样就是比较浪费工作力，我还有师姐直接就把沉淀冻在-20，每次需要蛋白的话就拿出来超一超，我个人认为每次超声时间不长的话是不怎么影响的，但是还是根据自己的蛋白特性，条件都不一样的。
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怀挺！
14楼2017-02-15 17:35:42
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栾栾silence

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 新人求帮助 at 2017-02-14 16:50:53
我们实验室做诱导表达的诱导剂终浓度都是0.2mM，应该不算高吧...

我们实验室普遍使用1mM的IPTG。但是实验室不一样，条件还是有差别的。
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怀挺！
15楼2017-02-15 17:36:42
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栾栾silence

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by seascen2016 at 2017-02-14 19:01:16
IPTG吗？我们实验室用100uM
...

这个。。。比我们配的母液浓度都高，确定是对的?
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怀挺！
16楼2017-02-15 17:37:36
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ULYSSEESWB

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
降低iptg浓度，诱导前菌液冰浴降温
pet带有强启动子，实在不行换载体
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17楼2017-02-15 22:50:25
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lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: MolEPI+1 2017-02-18 01:08:57
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2017-02-18 01:09:10
如果实验室通用的条件做出来效果好，那就用这个条件。
如果做不出来，那么，诱导表达的所有条件都需要自己去摸索。包括但不限于诱导温度、IPTG浓度、转速。
实验室中别人的IPTG浓度0.2mM做得很好，但对于你的菌来说可能还是太高了。
如果不做正交的话，还是挺简单的。
我当初一开始也是按照前人的条件做，别人就结果很好，可我就是包涵体。最后经过摸索后，我的诱导温度、IPTG浓度都比其他人的小很多。
总之就是让它表达慢一点。不过这样的话要求你目的酶活性要高，不然量太少，后面没法做。

祝福楼主顺利~~~~~~~
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诸事顺遂
18楼2017-02-16 10:03:10
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也跟你一样，后面换载体pMAL-c2x就在上清了，你试试，我也正在做pull down，我们可以交流一下
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19楼2017-02-16 10:15:54
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寥落星晨

木虫 (小有名气)
用试剂破解细胞吧

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20楼2017-02-16 13:37:34
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