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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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drwhoknowss

新虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
上清过柱了吗?如果过了可以再过一次。得到纯化的蛋白是最终目标

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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
11楼2017-02-15 09:18:25
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新人求帮助

管理员

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
11楼: Originally posted by drwhoknowss at 2017-02-15 09:18:25
上清过柱了吗?如果过了可以再过一次。得到纯化的蛋白是最终目标

还没有,我现在还没做纯化,跑蛋白胶的目的是想看看表达量如何,结果发现上清蛋白太少了,所以就想问问是什么原因导致的

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12楼2017-02-15 09:26:43
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drwhoknowss

禁虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 新人求帮助 at 2017-02-15 09:26:43
还没有,我现在还没做纯化,跑蛋白胶的目的是想看看表达量如何,结果发现上清蛋白太少了,所以就想问问是什么原因导致的
...

不上柱其实没多少,毕竟不能超过本身蛋白太多。先过柱再说,纯化过后有才是真有

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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
13楼2017-02-15 10:15:47
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栾栾silence

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-02-16 07:48:27
引用回帖:
4楼: Originally posted by 新人求帮助 at 2017-02-14 16:45:35
超声时间过长不是会使蛋白变性吗?这样不会影响酶活性的测定吗...

超声时间过长会产生很多杂蛋白,而且可能会使目的蛋白破碎,所以所有的事情都不可能两全其美的,你可以把超声时间调成超1s,停1s(共15min,超2遍)。如果还是担心变性之类的,还是采用包涵体的方式提纯蛋白吧。
我表达的蛋白也会大多都在沉淀里,如果上清中有一些,我就不管沉淀,就提上清中的蛋白就好了,这样就是比较浪费工作力,我还有师姐直接就把沉淀冻在-20,每次需要蛋白的话就拿出来超一超,我个人认为每次超声时间不长的话是不怎么影响的,但是还是根据自己的蛋白特性,条件都不一样的。
怀挺!
14楼2017-02-15 17:35:42
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栾栾silence

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 新人求帮助 at 2017-02-14 16:50:53
我们实验室做诱导表达的诱导剂终浓度都是0.2mM,应该不算高吧...

我们实验室普遍使用1mM的IPTG。但是实验室不一样,条件还是有差别的。
怀挺!
15楼2017-02-15 17:36:42
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栾栾silence

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
8楼: Originally posted by seascen2016 at 2017-02-14 19:01:16
IPTG吗?我们实验室用100uM
...

这个。。。比我们配的母液浓度都高,确定是对的?
怀挺!
16楼2017-02-15 17:37:36
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ULYSSEESWB

超级版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
降低iptg浓度,诱导前菌液冰浴降温
pet带有强启动子,实在不行换载体
17楼2017-02-15 22:50:25
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lialee22

专家顾问

黑钻会员

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
xn8008: MolEPI+1 2017-02-18 01:08:57
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2017-02-18 01:09:10
如果实验室通用的条件做出来效果好,那就用这个条件。
如果做不出来,那么,诱导表达的所有条件都需要自己去摸索。包括但不限于诱导温度、IPTG浓度、转速。
实验室中别人的IPTG浓度0.2mM做得很好,但对于你的菌来说可能还是太高了。
如果不做正交的话,还是挺简单的。
我当初一开始也是按照前人的条件做,别人就结果很好,可我就是包涵体。最后经过摸索后,我的诱导温度、IPTG浓度都比其他人的小很多。
总之就是让它表达慢一点。不过这样的话要求你目的酶活性要高,不然量太少,后面没法做。

祝福楼主顺利~~~~~~~
诸事顺遂
18楼2017-02-16 10:03:10
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意萧02

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我也跟你一样,后面换载体pMAL-c2x就在上清了,你试试,我也正在做pull down,我们可以交流一下
19楼2017-02-16 10:15:54
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寥落星晨

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

20楼2017-02-16 13:37:34
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