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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 蛋白挂不到柱子上,求教
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菜菜菜豆豆

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白挂不到柱子上,求教 已有2人参与

发酵液沉淀，透析，冻干后，用强阳离子交换柱，做纯化，目的蛋白等电点8点多，用pH5的醋酸缓冲液，平衡和淋洗，蛋白都挂不到柱子上，都被冲跑了，很无奈。请大家帮我分析下。谢谢了。
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1楼 2017-01-21 15:34:43
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)
发酵液用硫酸铵沉淀的吗？为啥要冻干？会不会是样品中的盐去除不干净，电导太高导致的？

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读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
2楼2017-01-21 17:33:14
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菜菜菜豆豆

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by keke226 at 2017-01-21 17:33:14
发酵液用硫酸铵沉淀的吗？为啥要冻干？会不会是样品中的盐去除不干净，电导太高导致的？

是用硫酸铵沉淀的，透析过后才冻干的，电导率的曲线，一直很低，估计不是电导率的问题。另外，我使用蒸馏水做得透析，而不是用做纯化用的缓冲液，是不是和这个有一定关系
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3楼2017-01-22 09:25:55
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
菜菜菜豆豆: 金币+2, ★有帮助 2017-01-30 08:30:06
菜菜菜豆豆: 金币+1, ★有帮助 2017-01-30 08:34:09
1。柱子没平衡好。
2。蛋白和介质结合是局部电荷结合，并非和净电荷结合。所以依据pI选缓冲液，填料不一定可靠。同样条件可以试试阴离子Q的，还不挂柱，那就是柱子没平衡好。或者样品没处理好。
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4楼2017-01-22 11:20:50
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
菜菜菜豆豆: 金币+1, ★有帮助 2017-01-30 08:33:08
菜菜菜豆豆: 金币+1, ★有帮助 2017-01-30 08:35:44
你的实验过程说的太简单了，不太好分析问题出的哪儿？最好详细说明你的实验步骤。不挂柱原因很多，一般还是样品处理的问题
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5楼2017-01-22 14:11:29
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菜菜菜豆豆

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hc-material at 2017-01-22 11:20:50
1。柱子没平衡好。
2。蛋白和介质结合是局部电荷结合，并非和净电荷结合。所以依据pI选缓冲液，填料不一定可靠。同样条件可以试试阴离子Q的，还不挂柱，那就是柱子没平衡好。或者样品没处理好。

目的蛋白等电点8点多，用的强阳离子交换柱，缓冲液用pH5的醋酸缓冲液。平衡5个柱体积。样品为发酵液沉淀，离心，透析，冻干，冻干后并没有用缓冲液溶解。另外，上样时应怎么设置流速和体积等。
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6楼2017-01-23 12:22:26
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菜菜菜豆豆

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2017-01-22 14:11:29
你的实验过程说的太简单了，不太好分析问题出的哪儿？最好详细说明你的实验步骤。不挂柱原因很多，一般还是样品处理的问题

目的蛋白获得从发酵液硫酸铵沉淀，离心，透析（用蒸馏水透析），冻干浓缩。目的蛋白等电点8点多，用的强阳离子交换柱，用pH5的醋酸缓冲液。平衡用5个柱体积。流速都用1ml每分钟。上样这个阶段设置需要注意什么吗？
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7楼2017-01-23 12:31:39
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greenstone5389

铁杆木虫 (初入文坛)
pH5在离子交换时不算很低的pH 我低的用过3.5的 在确定蛋白不失活的情况下降低pH 另外强阳的SP胶很多蛋白都不挂 反到弱阳的CMcellulose
吸附的更多

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8楼2017-01-23 15:26:16
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ctttting

新虫 (初入文坛)
楼主 最后问题怎么解决的 遇到跟你一样的问题，求教！
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9楼2018-04-22 12:46:16
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chen_xiao_xu

银虫 (正式写手)
没事流穿模式纯化吗，就是不挂目的蛋白，挂杂质

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10楼2018-04-22 20:23:16
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