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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因，急求解决方案
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0220zy

新虫 (初入文坛)

[求助] 小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因，急求解决方案 已有2人参与

从文献中找的小鼠抗体重链的引物3条，找生工进行合成。Taq聚合酶是Takara的普通的，不是高保真的。

轻链一次就扩增出目的基因，重链一直扩增不出来。尝试了好多退火温度（55.58.60.62 结果如图.），延伸温度72，延伸时间42s和1min20s，循环数在30和35，电泳显示二聚体很多。

变性94℃30s，退火不同温度都是30s，延伸72℃有42s有1min20s的，循环30次的和35次的

现在怀疑是不是引物有问题，因为不是自己设计的，硕士论文中的重复性应该不高。
用cDNA模板跑内参引物，效果很好，条带很清晰很亮，模板应该没有问题。
看电泳图有些能隐约看到700bp处出来了条带，但是都不是很明显。

重链5‘Tm值61.56，GC为59.09；
重链3’第一条引物  Tm值62.70，GC为46.67
重链3’第二条引物  Tm值65.35，GC为59.26
重链3’第三条引物  Tm值63.07，GC为53.33

真的不知道该怎么办了。求大神支招啊，建议怎么设计反应条件！！！不胜感激

小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因，急求解决方案
1.jpg


小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因，急求解决方案-1
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小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因，急求解决方案-2
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小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因，急求解决方案-3
4.jpg@youlinglyw@wizardfan
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1楼 2017-01-17 22:22:49
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yt7777

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 0220zy at 2017-01-19 22:46:20
我只能等放假回来再试试了，你设计过这样类似的程序？到时候熟练大神啊
...

我用普通pcr仪试过效果还好，其实没什么复杂的，如果你要试一下到时候私信我即可，共同学习～

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0220zy
11楼2017-01-19 23:03:55
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普通回帖

yt7777

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议楼主做个梯度吧，Tm最低设定50℃，另外有可能是引物浓度高。。。
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2楼2017-01-18 01:17:10
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0220zy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yt7777 at 2017-01-18 01:17:10
建议楼主做个梯度吧，Tm最低设定50℃，另外有可能是引物浓度高。。。

你说的梯度是touchdown 么？实验室没有条件做梯度，只是最普通的pcr仪。
引物浓度确实有点高，是10uM，我准备再稀释，变成1uM，试试。

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3楼2017-01-18 08:05:30
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的样品取自什么组织和细胞，引物是针对哪部分啊？
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4楼2017-01-18 10:02:09
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yt7777

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 0220zy at 2017-01-18 08:05:30
你说的梯度是touchdown 么？实验室没有条件做梯度，只是最普通的pcr仪。
引物浓度确实有点高，是10uM，我准备再稀释，变成1uM，试试。
...

是的，普通的pcr仪应该也可以，自己写个程序。。。

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5楼2017-01-18 12:21:44
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0220zy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-01-18 10:02:09
你的样品取自什么组织和细胞，引物是针对哪部分啊？

我取的小鼠脾脏rna，反转录质量很好，引物是抗体重链的

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6楼2017-01-19 21:35:22
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xy1232123

新虫 (初入文坛)
换引物吧，以前扩过人的抗体轻重链，扩不出来的一般都是引物的问题

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7楼2017-01-19 21:56:32
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0220zy

新虫 (初入文坛)
放假前最后一次实验最出来了，还是94℃变性30s，退火59℃30s，延伸72℃增加到一分半，引物浓度变成1uM，上下游各加1ul。电泳结果还是挺好的！证明引物没问题

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8楼2017-01-19 22:44:21
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0220zy

新虫 (初入文坛)
小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因，急求解决方案-4

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9楼2017-01-19 22:44:41
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0220zy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yt7777 at 2017-01-18 12:21:44
是的，普通的pcr仪应该也可以，自己写个程序。。。
...

我只能等放假回来再试试了，你设计过这样类似的程序？到时候熟练大神啊

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10楼2017-01-19 22:46:20
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