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0220zy

新虫 (初入文坛)

[求助] 小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因,急求解决方案已有2人参与

从文献中找的小鼠抗体重链的引物3条,找生工进行合成。Taq聚合酶是Takara的普通的,不是高保真的。

轻链一次就扩增出目的基因,重链一直扩增不出来。尝试了好多退火温度(55.58.60.62 结果如图.),延伸温度72,延伸时间42s和1min20s,循环数在30和35,电泳显示二聚体很多。

变性94℃30s,退火不同温度都是30s,延伸72℃有42s有1min20s的,循环30次的和35次的

现在怀疑是不是引物有问题,因为不是自己设计的,硕士论文中的重复性应该不高。
用cDNA模板跑内参引物,效果很好,条带很清晰很亮,模板应该没有问题。
看电泳图有些能隐约看到700bp处出来了条带,但是都不是很明显。

重链5‘Tm值61.56,GC为59.09;
重链3’第一条引物  Tm值62.70,GC为46.67
重链3’第二条引物  Tm值65.35,GC为59.26
重链3’第三条引物  Tm值63.07,GC为53.33

真的不知道该怎么办了。求大神支招啊,建议怎么设计反应条件!!!不胜感激

小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因,急求解决方案
1.jpg


小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因,急求解决方案-1
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小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因,急求解决方案-2
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小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因,急求解决方案-3
4.jpg@youlinglyw@wizardfan
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0220zy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-01-18 10:02:09
你的样品取自什么组织和细胞,引物是针对哪部分啊?

我取的小鼠脾脏rna,反转录质量很好,引物是抗体重链的

发自小木虫Android客户端
6楼2017-01-19 21:35:22
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yt7777

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议楼主做个梯度吧,Tm最低设定50℃,另外有可能是引物浓度高。。。
2楼2017-01-18 01:17:10
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0220zy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yt7777 at 2017-01-18 01:17:10
建议楼主做个梯度吧,Tm最低设定50℃,另外有可能是引物浓度高。。。

你说的梯度是touchdown 么?实验室没有条件做梯度,只是最普通的pcr仪。
引物浓度确实有点高,是10uM,我准备再稀释,变成1uM,试试。

发自小木虫Android客户端
3楼2017-01-18 08:05:30
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jurkat.1640

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的样品取自什么组织和细胞,引物是针对哪部分啊?
4楼2017-01-18 10:02:09
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