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小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因，急求解决方案 已有2人参与
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从文献中找的小鼠抗体重链的引物3条，找生工进行合成。Taq聚合酶是Takara的普通的，不是高保真的。 轻链一次就扩增出目的基因，重链一直扩增不出来。尝试了好多退火温度（55.58.60.62 结果如图.），延伸温度72，延伸时间42s和1min20s，循环数在30和35，电泳显示二聚体很多。 变性94℃30s，退火不同温度都是30s，延伸72℃有42s有1min20s的，循环30次的和35次的 现在怀疑是不是引物有问题，因为不是自己设计的，硕士论文中的重复性应该不高。 用cDNA模板跑内参引物，效果很好，条带很清晰很亮，模板应该没有问题。 看电泳图有些能隐约看到700bp处出来了条带，但是都不是很明显。 重链5‘Tm值61.56，GC为59.09； 重链3’第一条引物 Tm值62.70，GC为46.67 重链3’第二条引物 Tm值65.35，GC为59.26 重链3’第三条引物 Tm值63.07，GC为53.33 真的不知道该怎么办了。求大神支招啊，建议怎么设计反应条件！！！不胜感激  1.jpg  2.jpg  3.jpg  4.jpg@youlinglyw@wizardfan |
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放假前最后一次实验最出来了，还是94℃变性30s，退火59℃30s，延伸72℃增加到一分半，引物浓度变成1uM，上下游各加1ul。电泳结果还是挺好的！证明引物没问题 发自小木虫Android客户端 |
8楼2017-01-19 22:44:21
2楼2017-01-18 01:17:10
3楼2017-01-18 08:05:30
jurkat.1640
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4楼2017-01-18 10:02:09