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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请问验证cds全长序列设计引物(cDNA模板)，后二十碱基几乎没有GC怎么办
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zhangdie

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问验证cds全长序列设计引物(cDNA模板)，后二十碱基几乎没有GC怎么办

为了设计这个引物我查了好多资料，pp5也下了学了但是验证cds的引物基本上只有前二十和后二十这种设计法，但我下游引物用了最后二十四个碱基CG含量才大概20%，退火温度五十都不到，跑出条带做了连接转化但结果都不是目的基因。有人说用utr区设计，但是我5‘utr只有十五个已知碱基，是需要先做个5race吗？或者前辈们有什么别的方法？求指点谢谢

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1楼 2017-01-03 16:07:09
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangdie at 2017-01-04 15:41:08
做过了，挑了十个菌都出了结果位置和我目的条带位置差不多，但测序回来都比对不上T T
...

怎么比对不上呢，你用T载的局部序列去比对看看呢

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
4楼2017-01-04 22:12:15
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zhangdie

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by MAS_rice at 2017-01-04 22:12:15
怎么比对不上呢，你用T载的局部序列去比对看看呢
...

我比过一次也让师姐比过一次，两个都是什么菌的基因序列，所以我想是不是特异性引物太差根本没克出我要的基因，升高退火温度就几乎没有条带，降低退火还会在500bp左右出现一堆别的条带。。。

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5楼2017-01-04 23:09:10
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-06 07:45:02
能扩出来应该可以用吧，要不然你把这个扩出来的前段连个T载，再测序看看是不是目的前段

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2楼2017-01-03 23:20:27
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zhangdie

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by MAS_rice at 2017-01-03 23:20:27
能扩出来应该可以用吧，要不然你把这个扩出来的前段连个T载，再测序看看是不是目的前段

做过了，挑了十个菌都出了结果位置和我目的条带位置差不多，但测序回来都比对不上T T

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3楼2017-01-04 15:41:08
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhangdie at 2017-01-04 23:09:10
我比过一次也让师姐比过一次，两个都是什么菌的基因序列，所以我想是不是特异性引物太差根本没克出我要的基因，升高退火温度就几乎没有条带，降低退火还会在500bp左右出现一堆别的条带。。。
...

你材料是哪个物种的啊？你比对的时候和你的cds参考序列比对了没？

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6楼2017-01-05 20:20:29
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zhangdie

新虫 (初入文坛)
我那个是一个植物fes基因，NCBI上没有一样的但是有别的植物的我看了看都是调控hsp70的照理说是没问题的，但就是全长去克就出不来，有没有别的设计引物的方法啊

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7楼2017-01-05 23:48:07
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhangdie at 2017-01-05 23:48:07
我那个是一个植物fes基因，NCBI上没有一样的但是有别的植物的我看了看都是调控hsp70的照理说是没问题的，但就是全长去克就出不来，有没有别的设计引物的方法啊
...

试试ncbi primer blast吧

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8楼2017-01-06 21:25:08
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
http://muchong.com/html/201602/9978826.html   看看这个贴
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9楼2017-01-06 21:30:59
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太阳的电子

新虫 (小有名气)
你这是根据氨基酸序列找基因吗？

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10楼2017-01-06 22:10:33
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