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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 尿素PAGE胶 尿素结晶问题
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回头再说

新虫 (初入文坛)

[求助] 尿素PAGE胶 尿素结晶问题

我最近在做尿素page胶，室内温度10度不到20度，15mL胶，6.3尿素（MP级别），ddH2O 2.75mL，30%丙烯酰胺 4mL，5 乘TBE 3mL，10%APS 90μl,
TEMED 2.3 μl。 配制的时候用先用超声把尿素溶解在ddH2O，放置了一会稍有一些尿素结晶，灌胶后放了2个小时都没有凝固（烧杯里剩下的还是纯液体），胶板和烧杯后来放在暖气片上过夜放置，早上来看烧杯子里剩下的部分胶里尿素都结晶了，成针状混在胶里面。胶板上肉眼看不到结晶，但是样品孔形状歪七扭八的，怎么配啊？还有怎么能快一点配胶？

尿素PAGE胶 尿素结晶问题
胶板今天早上的情况


尿素PAGE胶 尿素结晶问题-1
烧杯里剩余的胶，搅动以后的样子
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1楼 2016-12-28 10:44:17
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科学小覃

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 回头再说 at 2016-12-29 20:59:21
我用的是gelred，第一次用浸泡的方式泡了10分钟出头，无条带；第二次直接配在胶里，可以看到胶的颜色从红色逐渐变为黄色。 无论尿素溶解的怎么样都基本上没有条带，最后一次做只有一个marker有一个点。电压300V，电 ...

温度太低可以把所以需要的东西都放培养箱里，包括配体系及跑电泳过程。

gelred我们实验室也用，1它不能加到凝胶了，因为会使丙烯酰胺凝胶也着色，2它染单链核酸的灵敏度要比双链低1倍，3它染PAGE胶要比琼脂糖胶慢，建议染色1h
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回头再说
生物科学
10楼2016-12-30 08:45:18
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农夫山泉1992

新虫 (初入文坛)
低温对APS有影响，可以试试适当增加APS的量，TEMED的量不变，不过不要太多

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7楼2016-12-29 15:04:31
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回头再说

新虫 (初入文坛)
自己顶！d=====(￣▽￣*)b一下
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2楼2016-12-28 10:50:04
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回头再说

新虫 (初入文坛)
尿素6.3g
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3楼2016-12-28 11:00:44
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科学小覃

木虫 (正式写手)
温度太低了，可以放烘箱或培养箱里，37度。
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生物科学
4楼2016-12-29 08:38:47
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新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 科学小覃 at 2016-12-29 08:38:47
温度太低了，可以放烘箱或培养箱里，37度。

你好，我昨天重新配加了过量的TEMED，胶很快凝固了，但是拔梳子时胶里面出现了几个孔，我觉得我用劲也不大，还有跑这种胶的maker跟琼脂糖凝胶使用的不一样吗？我跑了marker和样品，照相啥都没有，蓝色溴酚蓝一直跑到马上到胶底

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2016-12-29 09:46:31
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
”板和烧杯后来放在暖气片上过夜放置“

暖气片上放一杯水过夜也蒸干了吧？
我没有暖气片，没经验。。。
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6楼2016-12-29 13:59:21
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科学小覃

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 回头再说 at 2016-12-29 09:46:31
你好，我昨天重新配加了过量的TEMED，胶很快凝固了，但是拔梳子时胶里面出现了几个孔，我觉得我用劲也不大，还有跑这种胶的maker跟琼脂糖凝胶使用的不一样吗？我跑了marker和样品，照相啥都没有，蓝色溴酚蓝一直跑 ...

你用的什么染色方法？丙烯酰胺有荧光猝灭作用，因此EB或 SYBR Gold染色灵敏度要比琼脂糖低很多。可以增加染色时间，《分子克隆》上推荐的是30-45min。另外这两种染料都不能预加到凝胶里面。
跑变性核酸电泳时，maker和样品要经过95度变性和冰浴处理，以使完全变成单链，不然会出现条带模糊或变型。
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回头再说
生物科学
8楼2016-12-29 20:37:31
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新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
8楼: Originally posted by 科学小覃 at 2016-12-29 20:37:31
你用的什么染色方法？丙烯酰胺有荧光猝灭作用，因此EB或 SYBR Gold染色灵敏度要比琼脂糖低很多。可以增加染色时间，《分子克隆》上推荐的是30-45min。另外这两种染料都不能预加到凝胶里面。
跑变性核酸电泳时，ma ...

我用的是gelred，第一次用浸泡的方式泡了10分钟出头，无条带；第二次直接配在胶里，可以看到胶的颜色从红色逐渐变为黄色。 无论尿素溶解的怎么样都基本上没有条带，最后一次做只有一个marker有一个点。电压300V，电流20mA。感觉好费呀，gelred贵贵的。样品孔里有针状的阻挡物，照胶的时候没有目标条带反而有块状疑似是尿素的东西在胶里。室温较低，尿素结晶太快了。今天还有同学让我把尿素溶解后过滤，我怕我还来不及过滤完配胶它就又结晶了
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9楼2016-12-29 20:59:21
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