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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)

[求助] Qpcr检测mRNA水平Ct值较高35及以上以致复孔差异大无法统计，但是跑胶p出了目的条带 已有1人参与

Qpcr检测文献报道的某细胞里某基因mRNA水平，但是做出来Ct值较高35及以上以致复孔差异大无法统计，但是跑胶显示p出了目的条带只是条带较弱，怎么可以降低Ct值？cDNA未做稀释，且反转用的模板量已经2ug了，引物特异性也挺好的，是直接引用比较权威的杂志当中的引物。还有什么办法可以优化一下？

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1楼 2016-12-27 01:16:06
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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-03 07:46:51
一、提取的RNA条带怎么样，有没有降解？二、如果RNA质量没有问题，有特异性的条带。那么你可以先将cDNA进行预扩增，可以扩12个循环。然后用扩增的cDNA 作为模板进行上机实验。也能反映基因表达变化差异的趋势。
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2楼2016-12-27 07:59:36
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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by peitaokong at 2016-12-27 07:59:36
一、提取的RNA条带怎么样，有没有降解？二、如果RNA质量没有问题，有特异性的条带。那么你可以先将cDNA进行预扩增，可以扩12个循环。然后用扩增的cDNA 作为模板进行上机实验。也能反映基因表达变化差异的趋势。

预扩增是要特定的试剂盒做吗？

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3楼2016-12-27 08:17:41
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warkan

金虫 (正式写手)
调整阈值

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4楼2016-12-27 08:28:09
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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by w雨过天晴j at 2016-12-27 08:17:41
预扩增是要特定的试剂盒做吗？
...

不用，就是用你的定量引物扩增就行了，就按普通的扩增程序就可以了。退火温度要比定量的退火的温度低一些。
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5楼2016-12-27 08:37:15
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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by warkan at 2016-12-27 08:28:09
调整阈值

可是现在做96孔板经常出现这种异常扩增曲线，不知道是怎么回事，做384就没有这种现象，这样调整阈值的话就不行了。
Qpcr检测mRNA水平Ct值较高35及以上以致复孔差异大无法统计，但是跑胶p出了目的条带



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6楼2016-12-27 10:48:54
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大东红日

木虫 (正式写手)
同样的问题，我现在都不知道实验是否还应该如何进行，ct值大于30且复孔偏差大。
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7楼2017-01-03 00:35:17
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star013

新虫 (知名作家)
我们可以帮您做qpcr

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8楼2017-01-03 10:24:00
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