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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)

[求助] Qpcr检测mRNA水平Ct值较高35及以上以致复孔差异大无法统计,但是跑胶p出了目的条带 已有1人参与

Qpcr检测文献报道的某细胞里某基因mRNA水平,但是做出来Ct值较高35及以上以致复孔差异大无法统计,但是跑胶显示p出了目的条带只是条带较弱,怎么可以降低Ct值?cDNA未做稀释,且反转用的模板量已经2ug了,引物特异性也挺好的,是直接引用比较权威的杂志当中的引物。还有什么办法可以优化一下?

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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-03 07:46:51
一、提取的RNA条带怎么样,有没有降解?二、如果RNA质量没有问题,有特异性的条带。那么你可以先将cDNA进行预扩增,可以扩12个循环。然后用扩增的cDNA 作为模板进行上机实验。也能反映基因表达变化差异的趋势。
2楼2016-12-27 07:59:36
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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by peitaokong at 2016-12-27 07:59:36
一、提取的RNA条带怎么样,有没有降解?二、如果RNA质量没有问题,有特异性的条带。那么你可以先将cDNA进行预扩增,可以扩12个循环。然后用扩增的cDNA 作为模板进行上机实验。也能反映基因表达变化差异的趋势。

预扩增是要特定的试剂盒做吗?

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3楼2016-12-27 08:17:41
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warkan

金虫 (正式写手)

4楼2016-12-27 08:28:09
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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by w雨过天晴j at 2016-12-27 08:17:41
预扩增是要特定的试剂盒做吗?
...

不用,就是用你的定量引物扩增就行了,就按普通的扩增程序就可以了。退火温度要比定量的退火的温度低一些。
5楼2016-12-27 08:37:15
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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by warkan at 2016-12-27 08:28:09
调整阈值

可是现在做96孔板经常出现这种异常扩增曲线,不知道是怎么回事,做384就没有这种现象,这样调整阈值的话就不行了。
Qpcr检测mRNA水平Ct值较高35及以上以致复孔差异大无法统计,但是跑胶p出了目的条带



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6楼2016-12-27 10:48:54
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大东红日

木虫 (正式写手)

同样的问题,我现在都不知道实验是否还应该如何进行,ct值大于30且复孔偏差大。
7楼2017-01-03 00:35:17
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star013

新虫 (知名作家)


8楼2017-01-03 10:24:00
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