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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆启动子的方法
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jinnini125

木虫 (小有名气)

[求助] 克隆启动子的方法

目前只拿到了三个基因的开放阅读框，没有全长，如何拿到基因的启动子？基因组步移？TRIL PCR？谁具体操作过？指点一二，谢谢。

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1楼 2016-12-17 10:22:43
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976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-17 11:08:09
先买个基因组试剂盒，用来提取细胞的基因组DNA，然后在PUBMED上设计该基因的启动子去，一般为转录起始位点上游2000，下游1000个bp，设计一对引物合成，用基因组DNA扩增启动子区就好了

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耻与众草之为伍，何亭亭而独芳！何不为人之所赏兮，深山穷谷委严霜。
2楼2016-12-17 11:00:30
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jinnini125

木虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-17 11:08:18
引用回帖:
2楼: Originally posted by 976592787 at 2016-12-17 11:00:30
先买个基因组试剂盒，用来提取细胞的基因组DNA，然后在PUBMED上设计该基因的启动子去，一般为转录起始位点上游2000，下游1000个bp，设计一对引物合成，用基因组DNA扩增启动子区就好了
...

提取植物细胞DNA，然后设计引物扩增就好了？关键是我的作物没有任何参考序列，没有基因组没有转录组。如何设计引物？

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3楼2016-12-17 11:05:40
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976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长
引用回帖:
3楼: Originally posted by jinnini125 at 2016-12-17 11:05:40
提取植物细胞DNA，然后设计引物扩增就好了？关键是我的作物没有任何参考序列，没有基因组没有转录组。如何设计引物？
...

那买genome walking的试剂盒就好，TAKARA就有的，按照试剂盒操作，主要是设计三条高退火温度的特异引物与试剂盒里的四条低退火温度非特异引物进行热不对称PCR

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耻与众草之为伍，何亭亭而独芳！何不为人之所赏兮，深山穷谷委严霜。
4楼2016-12-17 11:15:35
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jinnini125

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 976592787 at 2016-12-17 11:15:35
那买genome walking的试剂盒就好，TAKARA就有的，按照试剂盒操作，主要是设计三条高退火温度的特异引物与试剂盒里的四条低退火温度非特异引物进行热不对称PCR
...

不用试剂盒的话，热不对称PCR的六个引物可以自己设计出来不？

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5楼2016-12-17 11:18:00
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976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长
引用回帖:
5楼: Originally posted by jinnini125 at 2016-12-17 11:18:00
不用试剂盒的话，热不对称PCR的六个引物可以自己设计出来不？
...

那倒没试过，你可以看下网上有没有专门的在线软件可以做的

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耻与众草之为伍，何亭亭而独芳！何不为人之所赏兮，深山穷谷委严霜。
6楼2016-12-17 11:41:29
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jinnini125

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 976592787 at 2016-12-17 11:41:29
那倒没试过，你可以看下网上有没有专门的在线软件可以做的
...

好的，谢谢。

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7楼2016-12-17 11:44:00
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jinnini125

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 976592787 at 2016-12-17 11:15:35
那买genome walking的试剂盒就好，TAKARA就有的，按照试剂盒操作，主要是设计三条高退火温度的特异引物与试剂盒里的四条低退火温度非特异引物进行热不对称PCR
...

在用试剂盒之前，需要对自己的序列和模板进行验证？先用cDNA序列设计一对特异性引物来扩基因组DNA，测序验证？

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8楼2016-12-28 19:55:47
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