24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 4750  |  回复: 9

奶茶袜子

新虫 (初入文坛)

[求助] crispr敲除原理 已有6人参与

我看了几篇文献,知道cas9会在我设计好的序列下游pam的5'端3个bp处形成DBS。我现在设计的sgRNA是target了蛋白A第一个外显子的20bp,那样就能保证蛋白A不表达了?那在没有抗体的情况下我要怎么验证敲除效果?

发自小木虫IOS客户端
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
第一个外显子敲除了,ATG也就没了,后面的翻译序列也就乱了,具体可以比较敲除前后序列的变化。
如果检验是否敲除,标准方法是Southern blot。
2楼2016-12-13 10:46:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不要只看外显子,要先在外显子里面找到编码这个基因的起始密码子ATG的位置,找到之后在ATG后面选择gRNA序列
3楼2016-12-13 14:32:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

C小杨

新虫 (初入文坛)

以前做过在5’UTR和外显子双位点敲除,效果很好

发自小木虫Android客户端
4楼2016-12-13 14:44:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

crispr敲除原理
关注此贴,里面不定期讲一讲关于CRISPR机理方面的介绍
关于敲除效率验证,可以通过测序看看目的基因的敲除情况,以此判断目的基因是否被敲除
5楼2016-12-19 10:23:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

爱一生恋一世

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by C小杨 at 2016-12-13 14:44:37
以前做过在5’UTR和外显子双位点敲除,效果很好

你好,可以交流一下吗?我是打算做细胞基因敲除的。我只知道基因的cDNA序列,将这个序列拿到麻省理工学院的CRISPR Design:http://crispr.mit.edu/网站分析的时候。把大概100bp序列输入进去后,网站好像马上就给分析说没有合适的guide RNA序列,想请问你知道这该如何去处理吗?

发自小木虫IOS客户端
任何事情只有靠自己
6楼2017-08-07 07:56:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

庄小康

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 爱一生恋一世 at 2017-08-07 07:56:09
你好,可以交流一下吗?我是打算做细胞基因敲除的。我只知道基因的cDNA序列,将这个序列拿到麻省理工学院的CRISPR Design:http://crispr.mit.edu/网站分析的时候。把大概100bp序列输入进去后,网站好像马上就给分 ...

也来学习一下,期待有大神解答。。。。
7楼2017-08-07 10:03:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (初入文坛)

本帖仅楼主可见
8楼2018-02-08 11:21:46
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2016-12-13 10:46:27
第一个外显子敲除了,ATG也就没了,后面的翻译序列也就乱了,具体可以比较敲除前后序列的变化。
如果检验是否敲除,标准方法是Southern blot。

ATG不一定在第一个外显子上,要看cds从哪里开始的。验证的话,测序比较直接。
2019更好更棒!
9楼2018-02-08 17:21:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 爱一生恋一世 at 2017-08-07 07:56:09
你好,可以交流一下吗?我是打算做细胞基因敲除的。我只知道基因的cDNA序列,将这个序列拿到麻省理工学院的CRISPR Design:http://crispr.mit.edu/网站分析的时候。把大概100bp序列输入进去后,网站好像马上就给分 ...

选评分高的,没有off-target的sgRNA去合成,引物退火成双链,与载体链接。

我们之前用的px335(cas9)载体(mit-zhang lab),用bbsi酶切,与退火后的双链sgRNA连接,转化挑克隆测序。

选装有sgRNA的质粒转染细胞,抗性筛选阳性细胞。

验证敲除效果,验证off-target。
2019更好更棒!
10楼2018-02-08 17:27:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 奶茶袜子 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] RY:中国产出的科学垃圾论文,绝对数量和比例都世界第一 +7 zju2000 2026-04-14 18/900 2026-04-16 11:36 by 欢乐颂叶蓁
[考研] 322求调剂 +8 123安康 2026-04-12 15/750 2026-04-16 11:07 by Espannnnnol
[考研] 344求调剂 +8 丶风雪夜归人丶 2026-04-09 8/400 2026-04-16 10:49 by 圆心602
[考研] 求调剂 +11 小聂爱学习 2026-04-11 15/750 2026-04-15 21:57 by noqvsozv
[考研] 药学求调剂 +11 RussHu 2026-04-12 13/650 2026-04-15 19:07 by zhuwenxu
[考研] 085801电气专硕272求调剂 +19 电气李 2026-04-13 21/1050 2026-04-15 13:37 by 黑科技矿业
[考研] 335求调剂 +19 想上岸呀!! 2026-04-12 21/1050 2026-04-14 16:23 by Art1977
[考研] 农学0904 312求调剂 +4 Say Never 2026-04-11 4/200 2026-04-14 09:10 by zs92450
[考研] 300分求调剂 (085501机械专硕,本科扬大) +9 xu@841019 2026-04-11 10/500 2026-04-14 08:48 by 木木mumu~
[考研] 机械还有还有名额吗?太难了 +8 笑笑袁 2026-04-10 8/400 2026-04-14 08:44 by screening
[考研] 求调剂288 +7 ioodiiij 2026-04-10 9/450 2026-04-13 08:33 by Hayaay
[考研] 326求调剂 +6 Shansyn 2026-04-10 6/300 2026-04-12 09:46 by hammer3
[考研] 343求调剂 +9 王国帅 2026-04-10 9/450 2026-04-11 20:31 by dongdian1
[考研] 352 求调剂 +6 yzion 2026-04-11 8/400 2026-04-11 16:24 by 明月此时有
[考研] 求调剂,一志愿大连理工大学354分 +5 雨声余生 2026-04-11 6/300 2026-04-11 16:12 by 雨声余生
[考研] 机械专硕270求调剂,接受跨专业 +12 老师看看我吧aba 2026-04-09 14/700 2026-04-11 10:21 by laoshidan
[考研] 一志愿985机械学硕380求调剂 +5 关关雎鸠10 2026-04-11 5/250 2026-04-11 10:10 by 知念。A
[考研] 22408 352分求调剂0854类 +4 努力的夏末 2026-04-09 4/200 2026-04-11 09:57 by zhq0425
[考研] 22408 327分求调剂 +4 韵风kon 2026-04-10 4/200 2026-04-11 09:51 by 猪会飞
[考研] 22408调剂求助 +7 毂12 2026-04-09 9/450 2026-04-11 09:23 by 哦哦123
信息提示
请填处理意见