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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » crispr敲除原理
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奶茶袜子

新虫 (初入文坛)

[求助] crispr敲除原理 已有6人参与

我看了几篇文献，知道cas9会在我设计好的序列下游pam的5'端3个bp处形成DBS。我现在设计的sgRNA是target了蛋白A第一个外显子的20bp，那样就能保证蛋白A不表达了？那在没有抗体的情况下我要怎么验证敲除效果？

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1楼 2016-12-12 12:07:27
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一个外显子敲除了，ATG也就没了，后面的翻译序列也就乱了，具体可以比较敲除前后序列的变化。
如果检验是否敲除，标准方法是Southern blot。
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2楼2016-12-13 10:46:27
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zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不要只看外显子，要先在外显子里面找到编码这个基因的起始密码子ATG的位置，找到之后在ATG后面选择gRNA序列
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3楼2016-12-13 14:32:30
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C小杨

新虫 (初入文坛)
以前做过在5’UTR和外显子双位点敲除，效果很好

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4楼2016-12-13 14:44:37
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

crispr敲除原理
关注此贴，里面不定期讲一讲关于CRISPR机理方面的介绍
关于敲除效率验证，可以通过测序看看目的基因的敲除情况，以此判断目的基因是否被敲除
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5楼2016-12-19 10:23:28
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爱一生恋一世

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by C小杨 at 2016-12-13 14:44:37
以前做过在5’UTR和外显子双位点敲除，效果很好

你好，可以交流一下吗？我是打算做细胞基因敲除的。我只知道基因的cDNA序列，将这个序列拿到麻省理工学院的CRISPR Design：http：//crispr.mit.edu/网站分析的时候。把大概100bp序列输入进去后，网站好像马上就给分析说没有合适的guide RNA序列，想请问你知道这该如何去处理吗？

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任何事情只有靠自己
6楼2017-08-07 07:56:09
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庄小康

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 爱一生恋一世 at 2017-08-07 07:56:09
你好，可以交流一下吗？我是打算做细胞基因敲除的。我只知道基因的cDNA序列，将这个序列拿到麻省理工学院的CRISPR Design：http：//crispr.mit.edu/网站分析的时候。把大概100bp序列输入进去后，网站好像马上就给分 ...

也来学习一下，期待有大神解答。。。。
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7楼2017-08-07 10:03:16
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匿名

用户注销 (初入文坛)
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8楼2018-02-08 11:21:46
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2016-12-13 10:46:27
第一个外显子敲除了，ATG也就没了，后面的翻译序列也就乱了，具体可以比较敲除前后序列的变化。
如果检验是否敲除，标准方法是Southern blot。

ATG不一定在第一个外显子上，要看cds从哪里开始的。验证的话，测序比较直接。
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2019更好更棒!
9楼2018-02-08 17:21:37
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 爱一生恋一世 at 2017-08-07 07:56:09
你好，可以交流一下吗？我是打算做细胞基因敲除的。我只知道基因的cDNA序列，将这个序列拿到麻省理工学院的CRISPR Design：http：//crispr.mit.edu/网站分析的时候。把大概100bp序列输入进去后，网站好像马上就给分 ...

选评分高的，没有off-target的sgRNA去合成，引物退火成双链，与载体链接。

我们之前用的px335（cas9）载体（mit-zhang lab），用bbsi酶切，与退火后的双链sgRNA连接，转化挑克隆测序。

选装有sgRNA的质粒转染细胞，抗性筛选阳性细胞。

验证敲除效果，验证off-target。
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2019更好更棒!
10楼2018-02-08 17:27:41
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