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奶茶袜子

新虫 (初入文坛)

[求助] crispr敲除原理 已有6人参与

我看了几篇文献,知道cas9会在我设计好的序列下游pam的5'端3个bp处形成DBS。我现在设计的sgRNA是target了蛋白A第一个外显子的20bp,那样就能保证蛋白A不表达了?那在没有抗体的情况下我要怎么验证敲除效果?

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爱一生恋一世

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by C小杨 at 2016-12-13 14:44:37
以前做过在5’UTR和外显子双位点敲除,效果很好

你好,可以交流一下吗?我是打算做细胞基因敲除的。我只知道基因的cDNA序列,将这个序列拿到麻省理工学院的CRISPR Design:http://crispr.mit.edu/网站分析的时候。把大概100bp序列输入进去后,网站好像马上就给分析说没有合适的guide RNA序列,想请问你知道这该如何去处理吗?

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任何事情只有靠自己
6楼2017-08-07 07:56:09
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
第一个外显子敲除了,ATG也就没了,后面的翻译序列也就乱了,具体可以比较敲除前后序列的变化。
如果检验是否敲除,标准方法是Southern blot。
2楼2016-12-13 10:46:27
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zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不要只看外显子,要先在外显子里面找到编码这个基因的起始密码子ATG的位置,找到之后在ATG后面选择gRNA序列
3楼2016-12-13 14:32:30
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C小杨

新虫 (初入文坛)

以前做过在5’UTR和外显子双位点敲除,效果很好

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4楼2016-12-13 14:44:37
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