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酵母双杂交实验与pull down实验求助 已有1人参与
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大家好，小弟在做蛋白互作过程中碰到一些问题，特别向虫友们求助一下，实验材料是水稻的一个基因：具体如下： （1）我在做酵母双杂交的时候第一次在4缺板上互作得到一个酵母菌斑，并且用T7和AD的引物直接就扩到了基因，而第二次再筛库一次验证的时候，4缺板上得到了比较多的菌，当然有可能有同样的菌存在，但是这次跟上次一样去扩增，就是无法得到该基因，请帮我分析下可能有什么原因导致的问题？实验室师姐建议提取该酵母质粒，转化大肠再扩增测序，主要是菌斑上百个，请问是否可行？ （2）pull down实验，我起先用pGEX-6p-1这个GST标签载体构建，发现基本在沉淀中，这样是无法过柱纯化的，然后我又用了HIS标签的pET28a，pET32a，也是如此，最后有很多人说试试pMAL载体，我想购买了这个载体，但是发现可以买到pMAL-C5X和pMAL-P5X这两个载体，请问这两个载体，一个在胞质表达的蛋白，一个是能穿越质膜表达的蛋白有什么区别吗？（note：我的蛋白亚细胞定位位于膜上）。最后有没有谁用过的蛋白可以尽可能使蛋白溶于上清的。求推荐，谢谢各位虫友，求解答。 （如果能帮到我，必有更多金币回报，谢谢大家）@飞约疯人院@wizardfan@biostar2009 |
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你的蛋白容易沉，可能大肠杆菌胞内的环境不适合，建议试试穿膜周质表达，大肠杆菌周质空间是还原性的，你查一下，如果你的蛋白Cys非常多，建议周质表达，破碎方式可以不变，也可以用其他方式 发自小木虫Android客户端 |
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