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意萧02

木虫 (正式写手)

[求助] 酵母双杂交实验与pull down实验求助已有1人参与

大家好,小弟在做蛋白互作过程中碰到一些问题,特别向虫友们求助一下,实验材料是水稻的一个基因:具体如下:
(1)我在做酵母双杂交的时候第一次在4缺板上互作得到一个酵母菌斑,并且用T7和AD的引物直接就扩到了基因,而第二次再筛库一次验证的时候,4缺板上得到了比较多的菌,当然有可能有同样的菌存在,但是这次跟上次一样去扩增,就是无法得到该基因,请帮我分析下可能有什么原因导致的问题?实验室师姐建议提取该酵母质粒,转化大肠再扩增测序,主要是菌斑上百个,请问是否可行?
(2)pull down实验,我起先用pGEX-6p-1这个GST标签载体构建,发现基本在沉淀中,这样是无法过柱纯化的,然后我又用了HIS标签的pET28a,pET32a,也是如此,最后有很多人说试试pMAL载体,我想购买了这个载体,但是发现可以买到pMAL-C5X和pMAL-P5X这两个载体,请问这两个载体,一个在胞质表达的蛋白,一个是能穿越质膜表达的蛋白有什么区别吗?(note:我的蛋白亚细胞定位位于膜上)。最后有没有谁用过的蛋白可以尽可能使蛋白溶于上清的。求推荐,谢谢各位虫友,求解答。

(如果能帮到我,必有更多金币回报,谢谢大家)@飞约疯人院@wizardfan@biostar2009
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意萧02

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2016-11-17 15:01:36
可以考虑两个载体都试试,膜蛋白难度有点大

能说说两者的区别吗?
3楼2016-11-17 15:17:20
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意萧02

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 娟恋幸福 at 2016-11-25 22:31:43
您好,可以向您请教一下酵母双杂问题吗

可以

发自小木虫Android客户端
6楼2016-11-26 15:11:26
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意萧02

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 娟恋幸福 at 2016-11-27 13:43:34
我做酵母双杂时,涂二缺板长了好多的菌落,时间才1天,会不会是被污染了
...

自激活验证过了吗

发自小木虫Android客户端
9楼2016-11-27 20:09:03
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