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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌落pcr该怎么做
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y383514131

银虫 (小有名气)
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40楼: Originally posted by 20081118129 at 2016-11-23 12:24:49
取单克隆到500UL LB里边儿摇3-4个小时，也可以多摇一会，浑浊了之后，在无菌工作台往10uL的体系里加1uL做PCR即可

我就是取1ul结果p不出来，是不是要设温度梯度

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此事说来终觉浅，莫问出处便是真
41楼2016-11-23 16:46:38
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20081118129

新虫 (著名写手)

Drake
就用你p片段的温度啊，都有的

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42楼2016-11-23 16:47:26
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yakun123

铁虫 (小有名气)
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32楼: Originally posted by hattie919822 at 2016-11-18 16:52:52
一般我都是在超净工作台里面，用10微升的墙头将菌落挑进去10微升的无菌水里面，混匀，肉眼可看见稍微浑浊，然后取1微升作为模板。

这种方法有什么优势？相比于直接挑菌到pcr体系

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43楼2016-11-23 17:29:55
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看他们

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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10楼: Originally posted by zgs_2013 at 2016-11-16 13:04:00
挑菌落时选平皿上的单菌落，非常小的刚长出的那种，用无菌枪头刮下，放到10微升的无菌水搅拌，外观看起来稍微有点混浊。然后pcr时20微体系模板加1～5微就够了

我们都是挑到400ul的培养液中。那这种请问能保存多久？这样做的话是不是只是用于PCR，要是继续往下做的话还是要挑到培养液中，是吗？

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44楼2016-11-23 19:10:17
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yakun123

铁虫 (小有名气)
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22楼: Originally posted by C小杨 at 2016-11-17 17:20:43
菌落PCR比菌液PCR更容易出现假阳性，建议使用菌液PCR，摇菌2ml，2-3小时加一微升作模板即可。

能解释下为什么菌落比菌液更容易出现假阳性吗，另外长三个小时后，每种菌生长不一样，加入pcr体系的量肯定也不一样吧，那加入量的标准是什么呢？

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45楼2016-11-24 00:53:25
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yakun123

铁虫 (小有名气)
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38楼: Originally posted by xiaominzheng at 2016-11-22 22:31:09
看大家好多都是用的枪头挑菌，小建议：用牙签的尖尖沾一下确定碰着菌就好，然后抖两下就可以了。

我们也是用的牙签，但是我担心只是沾一下，在平板划线后，再加入到pcr体系是不是会太少了

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46楼2016-11-24 00:57:44
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yakun123

铁虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by ULYSSEESWB at 2016-11-17 08:04:14
菌有点就行，如果pcr体系肉眼看都浑浊就明显过量了，另外
95预变性至少5min以上吧...

预变性作用是使得细胞破开，从而使质粒或染色体变性，因此，预变性的温度要看是阴性菌（5分钟  大肠）还是阳性菌（8分钟  谷棒）

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47楼2016-11-24 01:05:36
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yakun123

铁虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-17 21:27:38
引用回帖:
40楼: Originally posted by 20081118129 at 2016-11-23 12:24:49
取单克隆到500UL LB里边儿摇3-4个小时，也可以多摇一会，浑浊了之后，在无菌工作台往10uL的体系里加1uL做PCR即可

500微升的LB是在EP管中，然后做的是菌液pcr，每个菌生长不同，如何确定培养时间和加入量呢，另外菌液pcr比菌落pcr好的地方在哪，楼上有人讲菌液pcr的假阳性更少有道理吗

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48楼2016-11-24 01:08:55
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y383514131

银虫 (小有名气)
引用回帖:
47楼: Originally posted by yakun123 at 2016-11-24 01:05:36
预变性作用是使得细胞破开，从而使质粒或染色体变性，因此，预变性的温度要看是阴性菌（5分钟  大肠）还是阳性菌（8分钟  谷棒）
...

确定能破开吗

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此事说来终觉浅，莫问出处便是真
49楼2016-11-24 08:17:13
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sibei1

新虫 (小有名气)
1预变性10分钟  2直接挑菌放进pcr管 3你应该说p里面的质粒吧！p不出来可能是转化出问题或者转错质粒4pcr试剂是否有问题

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时代遗孤
50楼2016-11-24 21:39:39
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