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jianglin0116

新虫 (初入文坛)

细菌涂板,长成单菌落之后,用灭菌的小枪头挑取单菌落,蘸在液体培养基里面吸打混匀,37℃,270r培养3小时,然后吸取一微升作为模板,pcr体系可以25微升,也可以50微升,体系里包括模板,引物,dntp,mg离子,k离子,酶,buffer等,看你是用单酶还是用MIX,如果用MIX的话很方便,推荐擎科生物公司的低盐金牌,菌p很给力,体系构成是,模板一微升,上下游引物各一微升,剩余用金牌MIX补齐就可以了,程序要看你引物的Tm值确定退火温度,延伸时间要看你片段大小,擎科的金牌mix延伸速度很快,5-10s/kb,短片段半个多小时就可以扩出来

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91楼2017-01-13 13:03:37
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451533993

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
88楼: Originally posted by 缘来是伊 at 2016-12-30 18:49:49
这个得看你的菌种,如果是大肠的话很容易的,如果是其他尤其是阳性菌的话需要裂解液裂解一下再做

请教一下 细菌的新种快速鉴定法

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每天进步一点点!~
92楼2017-01-13 15:02:52
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iayala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

其实分子实验的原则确实是具体问题具体分析,没有什么通用的方法。
就说个人的经验吧,别挑太多,一点点就够了;前边大变性的时间可以稍长,5~7min
93楼2017-01-13 16:02:41
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wkj5257

新虫 (小有名气)

菌多少没有多大关系的,可能就是转化呈现阴性

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分子生物学,未来科技的领导者
94楼2017-01-13 18:20:05
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预估预估

新虫 (正式写手)

用小抢头挑单个菌落。应该可以的。

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95楼2017-01-16 18:22:49
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迎风辉翔

铁虫 (初入文坛)

我认为主要是模板的问题,可煮沸10min,冷却离心取上清

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96楼2017-01-29 21:31:54
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王方平

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我在此可以跟你讲一下我菌检的习惯:
1、在每个平板上挑多个(一般16个)单克隆分别分开接种至加有载体对应抗生素的500μL的LB培养液中,37℃220rpm振荡培养8—10h;
2、去培养物作为模板(这是一个筛选过程,培养后你会发现有的培养物浑浊,有的澄清,我们做pcr扩增是只选择浑浊的培养物),利用载体上的通用引物或者目的序列的特异引物进行PCR扩增。在进行PCR扩增时一般会做个对照,在对照实验中不加任何模版,扩增体系其他成分正常,以验证体系的影响。另预变性的时间要比普通PCR的预设时间长,便于细菌胞壁的破裂。
希望能够帮到你
97楼2017-02-01 16:47:54
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chenmx1257

新虫 (初入文坛)

这些都是好经验。但是我们死活扩不出。换了一家公司的premix体系就怎么做都怎么成功了。

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98楼2017-05-24 09:29:11
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