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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌落pcr该怎么做
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jianglin0116

新虫 (初入文坛)
细菌涂板，长成单菌落之后，用灭菌的小枪头挑取单菌落，蘸在液体培养基里面吸打混匀，37℃，270r培养3小时，然后吸取一微升作为模板，pcr体系可以25微升，也可以50微升，体系里包括模板，引物，dntp，mg离子，k离子，酶，buffer等，看你是用单酶还是用MIX，如果用MIX的话很方便，推荐擎科生物公司的低盐金牌，菌p很给力，体系构成是，模板一微升，上下游引物各一微升，剩余用金牌MIX补齐就可以了，程序要看你引物的Tm值确定退火温度，延伸时间要看你片段大小，擎科的金牌mix延伸速度很快，5-10s/kb，短片段半个多小时就可以扩出来

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91楼2017-01-13 13:03:37
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451533993

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
88楼: Originally posted by 缘来是伊 at 2016-12-30 18:49:49
这个得看你的菌种，如果是大肠的话很容易的，如果是其他尤其是阳性菌的话需要裂解液裂解一下再做

请教一下 细菌的新种快速鉴定法

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每天进步一点点！~
92楼2017-01-13 15:02:52
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iayala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

其实分子实验的原则确实是具体问题具体分析，没有什么通用的方法。
就说个人的经验吧，别挑太多，一点点就够了；前边大变性的时间可以稍长，5~7min
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93楼2017-01-13 16:02:41
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wkj5257

新虫 (小有名气)
菌多少没有多大关系的，可能就是转化呈现阴性

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分子生物学，未来科技的领导者
94楼2017-01-13 18:20:05
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预估预估

新虫 (正式写手)
用小抢头挑单个菌落。应该可以的。

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95楼2017-01-16 18:22:49
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迎风辉翔

铁虫 (初入文坛)
我认为主要是模板的问题，可煮沸10min,冷却离心取上清

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96楼2017-01-29 21:31:54
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王方平

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我在此可以跟你讲一下我菌检的习惯：
1、在每个平板上挑多个（一般16个）单克隆分别分开接种至加有载体对应抗生素的500μL的LB培养液中，37℃220rpm振荡培养8—10h；
2、去培养物作为模板（这是一个筛选过程，培养后你会发现有的培养物浑浊，有的澄清，我们做pcr扩增是只选择浑浊的培养物），利用载体上的通用引物或者目的序列的特异引物进行PCR扩增。在进行PCR扩增时一般会做个对照，在对照实验中不加任何模版，扩增体系其他成分正常，以验证体系的影响。另预变性的时间要比普通PCR的预设时间长，便于细菌胞壁的破裂。
希望能够帮到你
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97楼2017-02-01 16:47:54
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chenmx1257

新虫 (初入文坛)
这些都是好经验。但是我们死活扩不出。换了一家公司的premix体系就怎么做都怎么成功了。

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98楼2017-05-24 09:29:11
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