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David_王

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引用回帖:

14楼: Originally posted by ULYSSEESWB at 2016-11-16 08:30:39
16℃连接不要过夜，1-2小时就行。是否Amp有问题？
设置各种阴性对照，测试菌株，Amp，T载体是否有问题

好的，谢谢建议，我会排查的。

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21楼2016-11-17 09:25:27

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kshdd

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你这样，把挑选的克隆子37℃过夜后用引物在P一次，看看条带大小。我还是感觉，你直接提质粒跑胶看结果不靠谱

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22楼2016-11-17 15:05:16

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意萧02

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
David_王: 金币+5, ★有帮助 2016-12-12 18:52:41

给你个比较实际性操作建议：
（1）酶切载体时可以先磷酸化一下，加0.5-1ul的Fast-AP，这样连接更容易些；
（2）4℃连接过夜
（3）NEB的T4连接酶

如果实在没办法，给你个绝招：无缝克隆！！！
推荐一款无缝连接的试剂盒：诺唯赞的multis chone kit，自从用了这个再也没用过T4，什么10k片段，互补载体构建都不成问题。
（因为好用，绝对不是推销，你也可以用其他公司的无缝克隆试剂盒，原理一模一样，没差别）；

感谢我吧！！！！

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23楼2016-11-17 15:35:45

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一起来旅行

银虫 (正式写手)

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★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-30 07:39:44

我以前也出现类似的情况，后来换了引物立马就出来了，可能是引物gc含量太高了，我之前的达到80%，一直菌p失败

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24楼2016-11-22 23:27:49

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David_王

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谢谢大家的建议和帮助。问题已经解决了。好久了，现在想起来总结一下。我重新overlap扩增了片段，回收回来浓度比以前高了，并且加A尾的过程延长到了30min，换了新的T载体（之前的时间可能有点久，效率比较低，现在回头看应该是自连比较多），用了蓝白斑预筛选，最后挑的8个克隆里有1个提质粒后酶切验证是正确，送测序也证明连上了，没有问题。同时做的另一个片段连T载体很顺利，6个克隆全都正确，看来大片段连T载体效率还是不太高的。

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25楼2016-12-12 18:57:25

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