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David_王

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
14楼: Originally posted by ULYSSEESWB at 2016-11-16 08:30:39
16℃连接不要过夜,1-2小时就行。是否Amp有问题?
设置各种阴性对照,测试菌株,Amp,T载体是否有问题

好的,谢谢建议,我会排查的。
21楼2016-11-17 09:25:27
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kshdd

金虫 (著名写手)

你这样,把挑选的克隆子37℃过夜后用引物在P一次,看看条带大小。我还是感觉,你直接提质粒跑胶看结果不靠谱

发自小木虫Android客户端
22楼2016-11-17 15:05:16
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
David_王: 金币+5, 有帮助 2016-12-12 18:52:41
给你个比较实际性操作建议:
(1)酶切载体时可以先磷酸化一下,加0.5-1ul的Fast-AP,这样连接更容易些;
(2)4℃连接过夜
(3)NEB的T4连接酶

如果实在没办法,给你个绝招:无缝克隆!!!
推荐一款无缝连接的试剂盒:诺唯赞的multis chone kit,自从用了这个再也没用过T4,什么10k片段,互补载体构建都不成问题。
(因为好用,绝对不是推销,你也可以用其他公司的无缝克隆试剂盒,原理一模一样,没差别);

感谢我吧!!!!
23楼2016-11-17 15:35:45
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一起来旅行

银虫 (正式写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-30 07:39:44
我以前也出现类似的情况,后来换了引物立马就出来了,可能是引物gc含量太高了,我之前的达到80%,一直菌p失败

发自小木虫Android客户端
24楼2016-11-22 23:27:49
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David_王

新虫 (初入文坛)

谢谢大家的建议和帮助。问题已经解决了。好久了,现在想起来总结一下。我重新overlap扩增了片段,回收回来浓度比以前高了,并且加A尾的过程延长到了30min,换了新的T载体(之前的时间可能有点久,效率比较低,现在回头看应该是自连比较多),用了蓝白斑预筛选,最后挑的8个克隆里有1个提质粒后酶切验证是正确,送测序也证明连上了,没有问题。同时做的另一个片段连T载体很顺利,6个克隆全都正确,看来大片段连T载体效率还是不太高的。
25楼2016-12-12 18:57:25
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amber99

铁虫 (初入文坛)

个人拙见:1,换平末端载体连接试试,有的片段末端加a不好加,我也遇到过,换了平末端载体就解决了。2,蓝白斑筛选一下再做菌落PCR吧

发自小木虫IOS客户端
26楼2016-12-15 19:31:36
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虫子大军

新虫 (初入文坛)

27楼2016-12-30 07:14:24
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firefly22

禁虫 (小有名气)

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28楼2016-12-30 16:06:45
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firefly22

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

29楼2016-12-30 16:08:10
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firefly22

禁虫 (小有名气)

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30楼2016-12-30 16:09:30
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