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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！
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David_王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by ULYSSEESWB at 2016-11-16 08:30:39
16℃连接不要过夜，1-2小时就行。是否Amp有问题？
设置各种阴性对照，测试菌株，Amp，T载体是否有问题

好的，谢谢建议，我会排查的。
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21楼2016-11-17 09:25:27
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kshdd

金虫 (著名写手)
你这样，把挑选的克隆子37℃过夜后用引物在P一次，看看条带大小。我还是感觉，你直接提质粒跑胶看结果不靠谱

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22楼2016-11-17 15:05:16
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
David_王: 金币+5, ★有帮助 2016-12-12 18:52:41
给你个比较实际性操作建议：
（1）酶切载体时可以先磷酸化一下，加0.5-1ul的Fast-AP，这样连接更容易些；
（2）4℃连接过夜
（3）NEB的T4连接酶

如果实在没办法，给你个绝招：无缝克隆！！！
推荐一款无缝连接的试剂盒：诺唯赞的multis chone kit，自从用了这个再也没用过T4，什么10k片段，互补载体构建都不成问题。
（因为好用，绝对不是推销，你也可以用其他公司的无缝克隆试剂盒，原理一模一样，没差别）；

感谢我吧！！！！
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23楼2016-11-17 15:35:45
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一起来旅行

银虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-30 07:39:44
我以前也出现类似的情况，后来换了引物立马就出来了，可能是引物gc含量太高了，我之前的达到80%，一直菌p失败

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24楼2016-11-22 23:27:49
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David_王

新虫 (初入文坛)
谢谢大家的建议和帮助。问题已经解决了。好久了，现在想起来总结一下。我重新overlap扩增了片段，回收回来浓度比以前高了，并且加A尾的过程延长到了30min，换了新的T载体（之前的时间可能有点久，效率比较低，现在回头看应该是自连比较多），用了蓝白斑预筛选，最后挑的8个克隆里有1个提质粒后酶切验证是正确，送测序也证明连上了，没有问题。同时做的另一个片段连T载体很顺利，6个克隆全都正确，看来大片段连T载体效率还是不太高的。
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25楼2016-12-12 18:57:25
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amber99

铁虫 (初入文坛)
个人拙见：1，换平末端载体连接试试，有的片段末端加a不好加，我也遇到过，换了平末端载体就解决了。2，蓝白斑筛选一下再做菌落PCR吧

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26楼2016-12-15 19:31:36
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虫子大军

新虫 (初入文坛)
Pcr片段最好也用taq酶

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27楼2016-12-30 07:14:24
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firefly22

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
28楼2016-12-30 16:06:45
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firefly22

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
29楼2016-12-30 16:08:10
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firefly22

禁虫 (小有名气)
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30楼2016-12-30 16:09:30
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