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David_王

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 457.5
帖子: 27
在线: 12.2小时
虫号: 2264004
注册: 2013-01-28
性别: MM
专业: 微生物药物

[求助] 求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！已有7人参与

目标是把重叠PCR获得的一个3kb的回收片段通过TA克隆连接到T载体上。PCR片段是通过Takara的高保真酶获得的，胶回收以后测得浓度是47ng/ul。将回收片段Taq酶加A尾（做的50ul的大体系，回收片段加了15ul，72℃延伸30min）。然后取了4.5ul的加A尾载体片段，加了0.5ul的pMD18-T，5ul的Solution 1
（Takara）16℃过夜连接。10ul连接体系全部转化DH5α感受态（康维世纪）涂Amp+板。板上几乎长满了，但挑出来摇过夜提质粒，电泳后发现大小

都在1300bp左右（考虑到质粒的超螺旋形态，应该都是空载体？）所以现在问题出在哪里？是overlap回收的PCR片段有问题吗？还是连接时回收片段和载体的比例有问题？求大神指点 /(ㄒoㄒ)/~~ 要毕业好着急~~~~~！

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推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例已经有0人回复

1楼2016-11-14 12:54:45

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意萧02

木虫 (正式写手)

应助: 41 (小学生)
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专业: 遗传学与生物信息学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
David_王: 金币+5, ★有帮助 2016-12-12 18:52:41

给你个比较实际性操作建议：
（1）酶切载体时可以先磷酸化一下，加0.5-1ul的Fast-AP，这样连接更容易些；
（2）4℃连接过夜
（3）NEB的T4连接酶

如果实在没办法，给你个绝招：无缝克隆！！！
推荐一款无缝连接的试剂盒：诺唯赞的multis chone kit，自从用了这个再也没用过T4，什么10k片段，互补载体构建都不成问题。
（因为好用，绝对不是推销，你也可以用其他公司的无缝克隆试剂盒，原理一模一样，没差别）；

感谢我吧！！！！