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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！
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David_王

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！ 已有7人参与

目标是把重叠PCR获得的一个3kb的回收片段通过TA克隆连接到T载体上。PCR片段是通过Takara的高保真酶获得的，胶回收以后测得浓度是47ng/ul。将回收片段Taq酶加A尾（做的50ul的大体系，回收片段加了15ul，72℃延伸30min）。然后取了4.5ul的加A尾载体片段，加了0.5ul的pMD18-T，5ul的Solution 1
（Takara）16℃过夜连接。10ul连接体系全部转化DH5α感受态（康维世纪）涂Amp+板。板上几乎长满了，但挑出来摇过夜提质粒，电泳后发现大小都在1300bp左右（考虑到质粒的超螺旋形态，应该都是空载体？）所以现在问题出在哪里？是overlap回收的PCR片段有问题吗？还是连接时回收片段和载体的比例有问题？求大神指点  /(ㄒoㄒ)/~~ 要毕业好着急~~~~~！
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1楼 2016-11-14 12:54:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

18721317208

新虫 (初入文坛)
★
kuaile5420: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-18 18:29:44
1.先加a尾，再胶回收，考虑到高保真酶的作用，建议头天做pcr，隔天加a。2.连接温度可以调整为22度过夜试试。3.一定要蓝白斑筛选，3000片段连接效率会非常低。正常情况就算提出质粒为空载，电泳检测应该也会在3000左右，不应该在1300，建议你可以用质粒做模板，扩增坚定试试。如果不行可以考虑送上海生工测序部试试，我就是生工专门做ta克隆的

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8楼2016-11-14 21:26:33
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一起来旅行

银虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-30 07:39:44
我以前也出现类似的情况，后来换了引物立马就出来了，可能是引物gc含量太高了，我之前的达到80%，一直菌p失败

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24楼2016-11-22 23:27:49
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David_王

新虫 (初入文坛)
谢谢大家的建议和帮助。问题已经解决了。好久了，现在想起来总结一下。我重新overlap扩增了片段，回收回来浓度比以前高了，并且加A尾的过程延长到了30min，换了新的T载体（之前的时间可能有点久，效率比较低，现在回头看应该是自连比较多），用了蓝白斑预筛选，最后挑的8个克隆里有1个提质粒后酶切验证是正确，送测序也证明连上了，没有问题。同时做的另一个片段连T载体很顺利，6个克隆全都正确，看来大片段连T载体效率还是不太高的。
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25楼2016-12-12 18:57:25
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普通回帖

wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-22 23:41:15
xn8008: 应助指数+1 2016-11-22 23:41:26
David_王: 金币+5, ★有帮助 2016-12-12 18:51:43
没有用蓝白斑方法进行预筛选？
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2016-11-14 16:47:29
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-22 23:41:38
xn8008: 应助指数+1 2016-11-22 23:41:43
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2016-11-14 16:47:29
没有用蓝白斑方法进行预筛选？

第一.taq加A效果不好，你可以用加A试剂盒试试，第二，18T加的少了吧~一般加A连接我们最多连接三个小时，效率很高的，没必要过夜

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···
3楼2016-11-14 17:31:50
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般大于2Kb的片段，都是通过双酶切连接到载体中去的。
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4楼2016-11-14 19:09:59
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David_王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2016-11-14 16:47:29
没有用蓝白斑方法进行预筛选？

没有，我们实验室都是用氨苄板直接筛选。以前连1K多的片段都能很容易挑到，这次做了两次，都是长满板但是挑出来质粒大小都不对。预筛选很有必要吗？
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5楼2016-11-14 21:13:02
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David_王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小冀- at 2016-11-14 17:31:50
第一.taq加A效果不好，你可以用加A试剂盒试试，第二，18T加的少了吧~一般加A连接我们最多连接三个小时，效率很高的，没必要过夜
...

18T要加1ul吗？感觉挑出来的质粒大小几乎都是T载体自连的样子？我还一度怀疑是我插入片段加少了……
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6楼2016-11-14 21:15:10
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David_王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-11-14 19:09:59
一般大于2Kb的片段，都是通过双酶切连接到载体中去的。

也想用双酶切，主要没有合适的克隆位点
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7楼2016-11-14 21:16:49
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by David_王 at 2016-11-14 21:15:10
18T要加1ul吗？感觉挑出来的质粒大小几乎都是T载体自连的样子？我还一度怀疑是我插入片段加少了……...

那你加A回收一下吧，本来他家的T载体很容易自连的

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···
9楼2016-11-14 21:45:50
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kshdd

金虫 (著名写手)
建议做克隆转化，感觉直接提质粒跑胶不靠谱

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10楼2016-11-15 00:40:44
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