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求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！已有7人参与
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目标是把重叠PCR获得的一个3kb的回收片段通过TA克隆连接到T载体上。PCR片段是通过Takara的高保真酶获得的，胶回收以后测得浓度是47ng/ul。将回收片段Taq酶加A尾（做的50ul的大体系，回收片段加了15ul，72℃延伸30min）。然后取了4.5ul的加A尾载体片段，加了0.5ul的pMD18-T，5ul的Solution 1 （Takara）16℃过夜连接。10ul连接体系全部转化DH5α感受态（康维世纪）涂Amp+板。板上几乎长满了，但挑出来摇过夜提质粒，电泳后发现大小  都在1300bp左右（考虑到质粒的超螺旋形态，应该都是空载体？）所以现在问题出在哪里？是overlap回收的PCR片段有问题吗？还是连接时回收片段和载体的比例有问题？求大神指点 /(ㄒoㄒ)/~~ 要毕业好着急~~~~~！ |
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-30 07:39:44
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-30 07:39:44
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我以前也出现类似的情况，后来换了引物立马就出来了，可能是引物gc含量太高了，我之前的达到80%，一直菌p失败 发自小木虫Android客户端 |
24楼2016-11-22 23:27:49
wangranjun
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广庭之惘然
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2楼2016-11-14 16:47:29
小冀-
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-22 23:41:38
xn8008: 应助指数+1 2016-11-22 23:41:43
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第一.taq加A效果不好，你可以用加A试剂盒试试，第二，18T加的少了吧~一般加A连接我们最多连接三个小时，效率很高的，没必要过夜 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-11-14 17:31:50
kaobo2012
木虫 (正式写手)
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4楼2016-11-14 19:09:59