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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！
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rhjilio

新虫 (小有名气)
问题在载体！

发自小木虫Android客户端
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11楼2016-11-16 06:58:53
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a6379137

木虫 (小有名气)
载体自连了吧

发自小木虫Android客户端
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12楼2016-11-16 07:12:24
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zhl745671365

新虫 (正式写手)
酶切位点加了吗
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13楼2016-11-16 08:19:24
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ULYSSEESWB

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
David_王: 金币+5, ★有帮助 2016-12-12 18:52:17
16℃连接不要过夜，1-2小时就行。是否Amp有问题？
设置各种阴性对照，测试菌株，Amp，T载体是否有问题
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14楼2016-11-16 08:30:39
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这种片段稍微大一点的基因不建议TA克隆，考虑酶切的方法把，而且连接也不建议过夜，一般1小时足以
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15楼2016-11-16 10:41:08
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David_王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 18721317208 at 2016-11-14 21:26:33
1.先加a尾，再胶回收，考虑到高保真酶的作用，建议头天做pcr，隔天加a。2.连接温度可以调整为22度过夜试试。3.一定要蓝白斑筛选，3000片段连接效率会非常低。正常情况就算提出质粒为空载，电泳检测应该也会在3000左 ...

先加A尾再胶回收目的是提高插入片段浓度吗？已经订了IPTG和X-Gal配了平板，打算做蓝白斑筛选，希望有效果。
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16楼2016-11-17 09:21:09
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David_王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by kshdd at 2016-11-15 00:40:44
建议做克隆转化，感觉直接提质粒跑胶不靠谱

连接后转化DH5α了呀
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17楼2016-11-17 09:21:56
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David_王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by rhjilio at 2016-11-16 06:58:53
问题在载体！

我也感觉载体可能有点问题，已经重新订了新的T载体，打算再试一下。
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18楼2016-11-17 09:22:37
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David_王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by a6379137 at 2016-11-16 07:12:24
载体自连了吧

感觉从质粒大小来看，像是载体自连了。按理来说不应该有这么多的自连啊……
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19楼2016-11-17 09:23:19
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David_王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by zhl745671365 at 2016-11-16 08:19:24
酶切位点加了吗

什么酶切位点？是pcr片段上吗？设计了两个酶切位点，打算后续从T载体上酶切回收用的。
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20楼2016-11-17 09:24:37
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