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David_王

新虫 (初入文坛)

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虫号: 2264004
注册: 2013-01-28
性别: MM
专业: 微生物药物

[求助] 求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！已有7人参与

目标是把重叠PCR获得的一个3kb的回收片段通过TA克隆连接到T载体上。PCR片段是通过Takara的高保真酶获得的，胶回收以后测得浓度是47ng/ul。将回收片段Taq酶加A尾（做的50ul的大体系，回收片段加了15ul，72℃延伸30min）。然后取了4.5ul的加A尾载体片段，加了0.5ul的pMD18-T，5ul的Solution 1
（Takara）16℃过夜连接。10ul连接体系全部转化DH5α感受态（康维世纪）涂Amp+板。板上几乎长满了，但挑出来摇过夜提质粒，电泳后发现大小

都在1300bp左右（考虑到质粒的超螺旋形态，应该都是空载体？）所以现在问题出在哪里？是overlap回收的PCR片段有问题吗？还是连接时回收片段和载体的比例有问题？求大神指点 /(ㄒoㄒ)/~~ 要毕业好着急~~~~~！

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1楼2016-11-14 12:54:45

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David_王

新虫 (初入文坛)

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谢谢大家的建议和帮助。问题已经解决了。好久了，现在想起来总结一下。我重新overlap扩增了片段，回收回来浓度比以前高了，并且加A尾的过程延长到了30min，换了新的T载体（之前的时间可能有点久，效率比较低，现在回头看应该是自连比较多），用了蓝白斑预筛选，最后挑的8个克隆里有1个提质粒后酶切验证是正确，送测序也证明连上了，没有问题。同时做的另一个片段连T载体很顺利，6个克隆全都正确，看来大片段连T载体效率还是不太高的。