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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！
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David_王

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！ 已有7人参与

目标是把重叠PCR获得的一个3kb的回收片段通过TA克隆连接到T载体上。PCR片段是通过Takara的高保真酶获得的，胶回收以后测得浓度是47ng/ul。将回收片段Taq酶加A尾（做的50ul的大体系，回收片段加了15ul，72℃延伸30min）。然后取了4.5ul的加A尾载体片段，加了0.5ul的pMD18-T，5ul的Solution 1
（Takara）16℃过夜连接。10ul连接体系全部转化DH5α感受态（康维世纪）涂Amp+板。板上几乎长满了，但挑出来摇过夜提质粒，电泳后发现大小都在1300bp左右（考虑到质粒的超螺旋形态，应该都是空载体？）所以现在问题出在哪里？是overlap回收的PCR片段有问题吗？还是连接时回收片段和载体的比例有问题？求大神指点  /(ㄒoㄒ)/~~ 要毕业好着急~~~~~！
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1楼 2016-11-14 12:54:45
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firefly22

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
28楼2016-12-30 16:06:45
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查看全部 32 个回答

wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-22 23:41:15
xn8008: 应助指数+1 2016-11-22 23:41:26
David_王: 金币+5, ★有帮助 2016-12-12 18:51:43
没有用蓝白斑方法进行预筛选？
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2016-11-14 16:47:29
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-22 23:41:38
xn8008: 应助指数+1 2016-11-22 23:41:43
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2016-11-14 16:47:29
没有用蓝白斑方法进行预筛选？

第一.taq加A效果不好，你可以用加A试剂盒试试，第二，18T加的少了吧~一般加A连接我们最多连接三个小时，效率很高的，没必要过夜

发自小木虫Android客户端
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···
3楼2016-11-14 17:31:50
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般大于2Kb的片段，都是通过双酶切连接到载体中去的。
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4楼2016-11-14 19:09:59
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查看全部 32 个回答
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