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[交流] 质粒重组已有3人参与

我目的基因和载体割胶回收后跑胶鉴定都鉴定到了，16摄氏度连接过夜后转入TG1感受态，再双酶切鉴定的时候，只有一个菌落鉴定到了，但测序时没测到，求大神指点迷津。我的载体有5000bp,目的基因105bp

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1楼 2016-10-22 12:14:20

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不爱做实验

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-23 22:20:05

1、保证目的基因片段和载体片段的有效回收，回收后点样看一下回收效率
2、连接时要保证试剂的合理使用量
3、转化时感受态的活性要保证

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2楼2016-10-22 12:26:26

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2楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-10-22 12:26:26
1、保证目的基因片段和载体片段的有效回收，回收后点样看一下回收效率
2、连接时要保证试剂的合理使用量
3、转化时感受态的活性要保证

我载体片段和目的基因割胶回收后测浓度为，载体12.5ng/uL,目的基因为2.4ng/uL,浓度测完后跑胶鉴定也跑到了条带，感受态细胞应该也是好的，因为我转化涂板后长出了很多菌斑，所以可能是连接出了问题，请问你前面说的连接试剂的合理使用是什么意思？

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3楼2016-10-23 16:15:24

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小冀-

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3楼: Originally posted by 17826858802 at 2016-10-23 16:15:24
我载体片段和目的基因割胶回收后测浓度为，载体12.5ng/uL,目的基因为2.4ng/uL,浓度测完后跑胶鉴定也跑到了条带，感受态细胞应该也是好的，因为我转化涂板后长出了很多菌斑，所以可能是连接出了问题，请问你前面说的 ...

你回收的浓度也太低了吧

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