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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒重组
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17826858802

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒重组 已有3人参与

我目的基因和载体割胶回收后跑胶鉴定都鉴定到了，16摄氏度连接过夜后转入TG1感受态，再双酶切鉴定的时候，只有一个菌落鉴定到了，但测序时没测到，求大神指点迷津。我的载体有5000bp,目的基因105bp

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1楼 2016-10-22 12:14:20
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-23 22:20:05
1、保证目的基因片段和载体片段的有效回收，回收后点样看一下回收效率
2、连接时要保证试剂的合理使用量
3、转化时感受态的活性要保证
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2楼2016-10-22 12:26:26
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17826858802

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-10-22 12:26:26
1、保证目的基因片段和载体片段的有效回收，回收后点样看一下回收效率
2、连接时要保证试剂的合理使用量
3、转化时感受态的活性要保证

我载体片段和目的基因割胶回收后测浓度为，载体12.5ng/uL,目的基因为2.4ng/uL,浓度测完后跑胶鉴定也跑到了条带，感受态细胞应该也是好的，因为我转化涂板后长出了很多菌斑，所以可能是连接出了问题，请问你前面说的连接试剂的合理使用是什么意思？

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3楼2016-10-23 16:15:24
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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3楼: Originally posted by 17826858802 at 2016-10-23 16:15:24
我载体片段和目的基因割胶回收后测浓度为，载体12.5ng/uL,目的基因为2.4ng/uL,浓度测完后跑胶鉴定也跑到了条带，感受态细胞应该也是好的，因为我转化涂板后长出了很多菌斑，所以可能是连接出了问题，请问你前面说的 ...

你回收的浓度也太低了吧
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···
4楼2016-10-23 19:30:54
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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3楼: Originally posted by 17826858802 at 2016-10-23 16:15:24
我载体片段和目的基因割胶回收后测浓度为，载体12.5ng/uL,目的基因为2.4ng/uL,浓度测完后跑胶鉴定也跑到了条带，感受态细胞应该也是好的，因为我转化涂板后长出了很多菌斑，所以可能是连接出了问题，请问你前面说的 ...

就是连接体系中各试剂的用量，一般载体：目的片段=1：3，或者适当加大目的片段量
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5楼2016-10-24 08:53:56
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17826858802

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-23 19:30:54
你回收的浓度也太低了吧...

我目的基因只有105bp啊！

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6楼2016-10-24 20:54:23
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17826858802

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-10-24 08:53:56
就是连接体系中各试剂的用量，一般载体：目的片段=1：3，或者适当加大目的片段量...

哦哦，谢谢，我的载体和目的基因是按1:7加的，还是没连上，我在做一次吧

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7楼2016-10-24 20:59:34
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小冀-

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6楼: Originally posted by 17826858802 at 2016-10-24 20:54:23
我目的基因只有105bp啊！
...

回收浓度和基因大小好像没有太大的关系
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···
8楼2016-10-24 21:08:49
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17826858802

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-24 21:08:49
回收浓度和基因大小好像没有太大的关系...

浓度是ng/uL,质量越大浓度越大啊

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9楼2016-10-24 21:15:27
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小冀-

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9楼: Originally posted by 17826858802 at 2016-10-24 21:15:27
浓度是ng/uL,质量越大浓度越大啊
...

倒没注意过这个，学习了
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···
10楼2016-10-24 21:25:30
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