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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » TA 克隆连接转化无结果
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Gengli0909

新虫 (初入文坛)

[求助] TA 克隆连接转化无结果 已有3人参与

大神们，我想问一下将质粒PCR用rtaq酶以后的产物胶回收然后用T载体连接试剂盒连接，转化至自己做的感受态DH5a中，已经重复了很多次，换了五个试剂盒了转化都没有任何菌落生长出，连试剂盒里的阳性对照都一个菌没长，好崩溃，拜托亲们帮帮忙，找一下原因，我愿意给出我所有的金币，但可能是新手有点少，帮帮忙

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1楼 2016-10-20 16:09:54
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Gengli0909

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by Demon黄 at 2016-10-20 17:05:22
不能加的，首先DH5a是没有抗性的（因为该菌里是没有质粒的，抗性基因存在于质粒上），其次用不含氨苄的LB的原因是让导入外源质粒的DH5a进行抗性表达。
你用了含氨苄的LB以后，有可能就抑制了其生长，就长不出来菌 ...

就说明一开始复苏的时候菌导进去的质粒还没表达就被Amp杀死了，很有道理，立刻试试，万分感谢

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8楼2016-10-20 17:25:33
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Demon黄

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是转化的时候出现问题
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2楼2016-10-20 16:34:26
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Gengli0909

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Demon黄 at 2016-10-20 16:34:26
会不会是转化的时候出现问题

有道理，能再细一点吗，比如说哪个步骤出了问题？

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3楼2016-10-20 16:41:08
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Demon黄

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Gengli0909 at 2016-10-20 16:41:08
有道理，能再细一点吗，比如说哪个步骤出了问题？
...

热休克后应该加入无氨苄抗性的LB，然后再摇菌50分钟
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4楼2016-10-20 16:51:15
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