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TA 克隆连接转化无结果已有3人参与
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大神们，我想问一下将质粒PCR用rtaq酶以后的产物胶回收然后用T载体连接试剂盒连接，转化至自己做的感受态DH5a中，已经重复了很多次，换了五个试剂盒了转化都没有任何菌落生长出，连试剂盒里的阳性对照都一个菌没长，好崩溃，拜托亲们帮帮忙，找一下原因，我愿意给出我所有的金币，但可能是新手有点少，帮帮忙 发自小木虫Android客户端 |
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不能加的，首先DH5a是没有抗性的（因为该菌里是没有质粒的，抗性基因存在于质粒上），其次用不含氨苄的LB的原因是让导入外源质粒的DH5a进行抗性表达。 你用了含氨苄的LB以后，有可能就抑制了其生长，就长不出来菌，或者长的很少（我曾经就用的含氨苄的LB，就是长不出来，后来才知道得用LB），你可以网上查查，或者看分子克隆这本书，都是用的不含氨苄的LB的。 |
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Gengli09096楼2016-10-20 17:05:22
zyfskj
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连接T载体，12到16小时，转入感受态。转化第一步，把连接产物加进去，连接T的基因大小也会影响你的转化结果。我之前连一个16k的基因，一个月都没做出来。再就是你操作过程中，加完样后用手轻轻拨几下就行，否则感受态容易破坏。冰上放置1小时，42度水浴1分30秒，冰上放置1分30秒，就可以加800LB，此LB无抗性。是为了让你的菌能长起来不至于被杀死。一个小时后，离心后留200微升涂布抗性平板。我们的平板是100ug/ml氨苄 ，用的JM109 发自小木虫Android客户端 |
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