| 查看: 3973 | 回复: 13 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
皮蛋同学新虫 (小有名气)
|
[求助]
连接-滚环扩增做了两个月只做出来一次，求大神指导！ 已有2人参与
|
|
|
最近在做连接-滚环扩增，做了两个月了，只做出来了一次。实验菜鸟求大神指导T-T 20ul 连接体系：10uM 锁式探针 4ul，10uM 目标物 2ul，10Xbuffer 2ul，T4连接酶 4U。 PCR仪 22度 1h，65度灭活10min。 10ul 连接产物加入 10ul 外切酶混合物，37度孵箱孵育 1h，水浴85度灭活 15min。 20ul 酶切产物加入引物4 ul（200nM）,Bst 酶 16U, buffer 4ul,dNTP 3.2ul, 水6.8ul， 水浴65度 2h 所有序列都是公司合成的，实验期间换过序列，换过酶，换过温度和时间，都做不出来。直到最近才做出来过一次，电泳出来有阶梯状条带，肉眼没有絮状物。（听师姐说他们做的滚环扩增都会出现肉眼可见絮状物，效果好的半小时就能出现）但之后又做过几次，酶切后和扩增后的样本电泳均没有任何条带。 现在有几个问题，一是请各位大神看看我的实验方法有没有错误，二是请问滚环扩增都能出现肉眼可见的絮状物吗？三是如果酶切后无电泳条带，是不是就意味着连接失败（理论上成环后应该是不能被酶切的）。实验拖了两三个月了，跪求大神指导T-T |
回复此楼» 猜你喜欢
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有68人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
9楼2017-04-24 10:31:06
2楼2016-10-13 16:45:08
3楼2016-10-17 09:21:22
4楼2016-11-03 16:46:22
20