| 查看: 4026 | 回复: 13 | ||
皮蛋同学新虫 (小有名气)
|
[求助]
连接-滚环扩增做了两个月只做出来一次，求大神指导！ 已有2人参与
|
|
|
最近在做连接-滚环扩增，做了两个月了，只做出来了一次。实验菜鸟求大神指导T-T 20ul 连接体系：10uM 锁式探针 4ul，10uM 目标物 2ul，10Xbuffer 2ul，T4连接酶 4U。 PCR仪 22度 1h，65度灭活10min。 10ul 连接产物加入 10ul 外切酶混合物，37度孵箱孵育 1h，水浴85度灭活 15min。 20ul 酶切产物加入引物4 ul（200nM）,Bst 酶 16U, buffer 4ul,dNTP 3.2ul, 水6.8ul， 水浴65度 2h 所有序列都是公司合成的，实验期间换过序列，换过酶，换过温度和时间，都做不出来。直到最近才做出来过一次，电泳出来有阶梯状条带，肉眼没有絮状物。（听师姐说他们做的滚环扩增都会出现肉眼可见絮状物，效果好的半小时就能出现）但之后又做过几次，酶切后和扩增后的样本电泳均没有任何条带。 现在有几个问题，一是请各位大神看看我的实验方法有没有错误，二是请问滚环扩增都能出现肉眼可见的絮状物吗？三是如果酶切后无电泳条带，是不是就意味着连接失败（理论上成环后应该是不能被酶切的）。实验拖了两三个月了，跪求大神指导T-T |
回复此楼» 猜你喜欢
拉坦前列腺素(Latanoprost)：前列腺素F2α衍生物如何成为青光眼一线用药
已经有0人回复
-
卟啉家族中的明星分子：MESO-四(3,5-二溴-4-羟基苯基)卟啉的性质与制备
已经有1人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有256人回复
-
宠物寄生虫防治：氟雷拉纳阻断GABA受体，持效12周驱杀跳蚤蜱虫
已经有0人回复
-
为呼吸打开通道：依伐卡托的科学之旅
已经有1人回复
-
Dordaviprone（ONC201）：小分子药物在中线胶质瘤中的应用
已经有0人回复
-
依喜替康：新型喜树碱衍生物的研究进展
已经有1人回复
-
膀胱癌靶向治疗新选择：厄达替尼作用机制与耐药研究进展
已经有0人回复
-
从水母到实验室：腔肠素的发现历程与生物发光奥秘
已经有1人回复
-
线粒体氧化磷酸化的新靶点：S-Gboxin的发现与研究进展
已经有0人回复
-
PROTAC药物开发选择VHL配体：MDK-7526以87%出口向量占有率成首选
已经有0人回复
baichi121234
禁虫 (职业作家)
|
本帖内容被屏蔽 |
5楼2016-11-03 17:11:36
2楼2016-10-13 16:45:08
3楼2016-10-17 09:21:22
4楼2016-11-03 16:46:22
盐津咖啡豆
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 21.5
- 散金: 5
- 帖子: 12
- 在线: 16.2小时
- 虫号: 4339127
- 注册: 2016-01-07
- 性别: GG
- 专业: 生化分析及生物传感
6楼2017-04-01 23:12:46
盐津咖啡豆
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 21.5
- 散金: 5
- 帖子: 12
- 在线: 16.2小时
- 虫号: 4339127
- 注册: 2016-01-07
- 性别: GG
- 专业: 生化分析及生物传感
7楼2017-04-01 23:13:22
盐津咖啡豆
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 21.5
- 散金: 5
- 帖子: 12
- 在线: 16.2小时
- 虫号: 4339127
- 注册: 2016-01-07
- 性别: GG
- 专业: 生化分析及生物传感
8楼2017-04-01 23:13:47
9楼2017-04-24 10:31:06
我不是分割线
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 186.1
- 散金: 50
- 帖子: 172
- 在线: 29.3小时
- 虫号: 7068154
- 注册: 2017-08-16
- 性别: MM
- 专业: 生化分析及生物传感
|
我也做出来有絮状物，然后用DNA产物回收试剂盒纯化后测有荧光，但是电泳却没有条带，师兄说是纯化后浓度降低了。而且我后面又做了一次，加了外切酶酶切，反应时间缩短后产物就不粘稠了，测荧光值也还可以，但是没有之前那么高 发自小木虫IOS客户端 |
10楼2017-11-09 17:13:34
10