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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 新药研发 » 资料求助 » HPLC方法开发
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guozhonglong

银虫 (正式写手)

[求助] HPLC方法开发 已有4人参与

各位：
       我在做HPLC方法开发时，在4.9min处出现一个小峰，试了很多方法都除不掉，请各位多多指教！
       流动相：A是40mM的KH2PO4
                     B是乙腈
        溶剂：梯度的起始比例A：B=96：4.
       可以确定4.9min杂峰是溶剂引入的，因此溶剂尝试了不同比例的A和B，NH4H2PO4及NaH2PO4均除不掉。
请各位大师不吝赐教！
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1楼 2016-09-28 17:11:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

晴川沥沥

新虫 (小有名气)
先冲一下系统，用纯水相溶或者纯乙腈溶解样品看看，多进两针，或者乙腈换一个厂家试试，或者换成屈臣氏水。

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4楼2016-09-29 19:12:05
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星海慧儿

荣誉版主 (职业作家)

木虫精灵

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
guozhonglong: 金币+3, ★有帮助 2016-09-29 19:45:32
guozhonglong: 金币+8, ★有帮助 2016-09-29 20:07:41
不管怎么调整，这个小峰的面积一直没变过？你怎么判定就是溶剂引起的呢？不论它是溶剂峰还是溶剂里面的杂质峰，随着溶剂比例德邦变化，它的大小总会有变化的啊，你多给些信息，越详细越好，这样才能帮你判断，不然很难判断的。
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我是超级天后：天天努力，不落人后！
2楼2016-09-29 09:19:26
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星海慧儿

荣誉版主 (职业作家)

木虫精灵

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by guozhonglong at 2016-09-29 20:07:31
1.你好，在不吸取溶剂，空走一针，基线很平，而走空白溶剂就有那个小峰，所以说是溶剂里面引入的；
2.在流动相为KH2PO4，当进10ul时，小峰的面积基本保持在0.0250mAU，当进20ul时，小峰的面积在0.060mAU。流动相为 ...

这样的话，溶剂峰的可能性很大。这样的话建议楼主试试微调色谱条件，比如稍微增大柱温，微调高流速，或者更换其他柱子。
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我是超级天后：天天努力，不落人后！
6楼2016-09-30 09:45:24
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lidancpu

新虫 (初入文坛)
遇到过同样的问题，应该是系统脏了。把系统好好冲一下
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7楼2016-09-30 14:20:20
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柳絮虫

新虫 (职业作家)
如果真能”确定4.9min杂峰是溶剂引入的”，那就确定溶剂纯化。但是，通常是方法有瑕疵，换换柱温，柱子等基本条件，或者换台仪器，看看是否真是溶剂问题。再说了，若这个小峰不影响你的检测，就不必太关注。
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10楼2016-09-30 16:06:44
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1045051083

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
若溶剂空白能扣除，且不影响样品检测，就可不需在意
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但愿一切随你愿
11楼2016-09-30 17:06:11
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543799152

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.考虑换配流动相的水，如娃哈哈或其它优质瓶装水；
2.考虑换进口乙腈，如天地、默克品牌的；
3.梯度初始有机相比例不宜低于5％，除非柱子允许的；
4.磷酸盐缓冲溶液浓度适用，应有合理的pH值，不一定是纯盐，可用酸碱调整至所需pH；
5.柱子与流动相匹配，否则换柱子或流动相

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12楼2016-09-30 20:13:19
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普通回帖

jixfeng

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
guozhonglong: 金币+3, ★有帮助 2016-09-29 19:45:42
2、换高纯度试剂
1、清洗进样系统
3、换波长
4、换亲水性（相对而言，不特指明亲水柱），或者能快速平衡额色谱柱

此4条考虑的角度各不相同
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不要寻找借口
3楼2016-09-29 17:03:33
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guozhonglong

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 星海慧儿 at 2016-09-29 09:19:26
不管怎么调整，这个小峰的面积一直没变过？你怎么判定就是溶剂引起的呢？不论它是溶剂峰还是溶剂里面的杂质峰，随着溶剂比例德邦变化，它的大小总会有变化的啊，你多给些信息，越详细越好，这样才能帮你判断，不然很 ...

1.你好，在不吸取溶剂，空走一针，基线很平，而走空白溶剂就有那个小峰，所以说是溶剂里面引入的；
2.在流动相为KH2PO4，当进10ul时，小峰的面积基本保持在0.0250mAU，当进20ul时，小峰的面积在0.060mAU。流动相为NaH2PO4,面积为基本是0.0350。流动相为 NH4H2PO4,面积为基本是0.040。
3.在流动相为KH2PO4时，溶剂：A:B=98：2,小峰面积0.0414，A:B=96：4,面积为0.0258，A:B=94:6，面积为0.0335.
4.超纯水和屈臣氏水都试过了，除不去。
请大师多多指教！
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5楼2016-09-29 20:07:31
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guozhonglong

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 星海慧儿 at 2016-09-30 09:45:24
这样的话，溶剂峰的可能性很大。这样的话建议楼主试试微调色谱条件，比如稍微增大柱温，微调高流速，或者更换其他柱子。...

非常感谢！
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8楼2016-09-30 15:18:04
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guozhonglong

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lidancpu at 2016-09-30 14:20:20
遇到过同样的问题，应该是系统脏了。把系统好好冲一下

谢谢！
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9楼2016-09-30 15:18:22
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