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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 目的蛋白与杂蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子筛Superdex柱子分不开？
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huaizhenkai

新虫 (小有名气)

[求助] 目的蛋白与杂蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子筛Superdex柱子分不开？ 已有4人参与

鄙人刚开始接触蛋白纯化，碰到的问题如下还忘各位高手踊跃回答。
    我的目的蛋白包含10His tag，分子量约32kd。首先利用FF镍柱纯化后的结果见图1右边两条带：可见除目的蛋白之外，还有两条杂蛋白带（约70kd和110kd左右）；再查询文献之后（目的蛋白为老靶点蛋白，已经有人纯化过该蛋白），决定尝试Superdex 75 10/300 GL（全新的）利用AKTA purifier分离纯化，吸收图结果如图2（忘记保存了，大概峰形见手绘图），按照峰形接收蛋白洗脱液时，将洗脱液接收为12管，每管200-500 微升不等，然后跑SDS-PAGE胶结果如图3，蛋白完全没分开啊？？因此问题如下：

1.  杂蛋白按照分子量来像目的蛋白的二三聚体，怎么确定？
2.  Superdex 75柱子分离范围为3-70 kd，理论上只要杂蛋白和目的蛋白分子量差一倍就可以使用该柱子分离，但是为什么我的蛋白完全没有分开？从峰开始，中间，结尾分开接收的11 管洗脱液跑出来的胶完全一个样子，都是三条带？

3，看了几篇质量还可以的文献，他们都是过了镍柱和分子筛，纯度就可以上核磁了，我这分子筛完全分不开，是我实验过程中出了问题，还是。。？

忘高手指点啊

目的蛋白与杂蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子筛Superdex柱子分不开？
1 镍柱纯化结果.jpg


目的蛋白与杂蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子筛Superdex柱子分不开？-1
2. AKTA吸收峰图.jpg


目的蛋白与杂蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子筛Superdex柱子分不开？-2
3. Superdex 75 洗脱液胶图


目的蛋白与杂蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子筛Superdex柱子分不开？-3
1.镍柱纯化结果.jpg
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好好学习，天天向上！
1楼 2016-09-24 14:22:34
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
huaizhenkai: 金币+5, ★有帮助 2016-09-26 11:12:34
如你所说，Superdex 75柱子分离范围为3-70 kd，如果杂蛋白是大于70kd，理论上你杂蛋白是外水全排阻，可以实现分离。但是杂蛋白的分子量也有些是小与70kd的。所以这个分子筛实现你目标蛋白更高纯度的纯化很难实现。你可以考虑你目标蛋白和杂蛋白的电荷情况，结合离子交换介质试试。祝你顺利。
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6楼2016-09-26 09:24:01
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
上面我说错了，你这个是大的蛋白先出来吧，所以只收后一个峰的后一半
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2016-09-25 08:10:41
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milamiya

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
huaizhenkai: 金币+5, ★有帮助 2016-09-26 12:30:18
本帖内容被屏蔽
8楼2016-09-26 10:48:09
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by huaizhenkai at 2016-09-26 11:11:52
你好，谢谢你的解答。
1. Buffer中是有1mM DTT的。不好意思，不太明白你说的？你说的Western blotting方法，因为我的目的蛋白含有His-tag就可以区分二三聚体了？？聚体区分原理是什么，可以说的详细一些吗？
2.  ...

1. WB看看两个大小的位置是否都有你的tag。如果都有，就很有可能是多聚体。
2. 主要是看是否高于柱子饱和上限了，你如果担心可以降低上样量。非变性胶就是native-page。
3. 拿到二维应该可以很容易分辨出大概的氨基酸个数，特别是想色氨酸这种，出峰位置特别，可以数出来的。如果样品中有大量其他蛋白，很容易就辨认出来了。至于多聚体之类的，估计要区分比较困难。

另外楼下说的离子交换你可以试试，蛋白分离无外乎就是亲和柱，离子交换柱和分子筛三种手段。
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12楼2016-09-26 13:27:07
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普通回帖

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
huaizhenkai: 金币+6, ★有帮助 2016-09-26 10:41:47
1. SDS-PAGE 是变性胶，大多数情况二三聚体不会出现。
2. 不要贪图产率，收两个峰中间的组分。 纯度第一，产率第二。试下只收第一个峰的前一半。
3. 实在不行就换实验方法，比如用钴柱取代镍柱。或者N端一个标签，C端再来个纯化标签
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huaizhenkai
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2016-09-25 08:09:15
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hya1968


发自小木虫Android客户端
4楼2016-09-25 15:18:00
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
huaizhenkai: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-09-26 10:41:35
1. PAGE上样的buffer是否含有还原性的DTT或者巯基乙醇？如果没有，加点试试。蛋白可能通过二硫键形成多聚体，跟是否SDS变性无关@二楼。当然你也可以做WB，你的蛋白含有HIS-tag。这样可以判断其他两个是否也是你的蛋白多聚体。
2. 按照你的描述，这些蛋白都一起下柱的话，如果不是你上样量过大的话，还有另外一种可能是这些蛋白和你的蛋白结合，比如是伴侣蛋白。DnaK和GroES都是70KDa左右。你也可以跑非变性胶判断。
3. 这个很难说，建议你试试我上面讲的。当然，你是土豪的话直接做核磁看个二维HSQC也可以判断吧：）。
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5楼2016-09-25 18:30:23
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huaizhenkai

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2016-09-25 08:09:15
1. SDS-PAGE 是变性胶，大多数情况二三聚体不会出现。
2. 不要贪图产率，收两个峰中间的组分。 纯度第一，产率第二。试下只收第一个峰的前一半。
3. 实在不行就换实验方法，比如用钴柱取代镍柱。或者N端一个标签， ...

你好，谢谢你的答复。。虽然我都接收了两个峰的洗脱液，但是接收了多管，其中最后一个峰的后半端就接受了2-3管，跑出来的PAGE胶就是图三中的其中三条带，还是两条蛋白条带，所以我不认为是我收的原因。再确定这两个杂蛋白是不是我的二三聚体之后，实在不行考虑换其他的实验方法。
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好好学习，天天向上！
7楼2016-09-26 10:39:56
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huaizhenkai

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuweitao at 2016-09-25 18:30:23
1. PAGE上样的buffer是否含有还原性的DTT或者巯基乙醇？如果没有，加点试试。蛋白可能通过二硫键形成多聚体，跟是否SDS变性无关@二楼。当然你也可以做WB，你的蛋白含有HIS-tag。这样可以判断其他两个是否也是你的蛋 ...

你好，谢谢你的解答。
1. Buffer中是有1mM DTT的。不好意思，不太明白你说的？你说的Western blotting方法，因为我的目的蛋白含有His-tag就可以区分二三聚体了？？聚体区分原理是什么，可以说的详细一些吗？
2. 我的上样蛋白挺浓的，上样量800微升，浓度用Protein 280 的方法大于10mg了，你的意思是我可以降低浓度再上下柱子试一下？我在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白时候，也可以表达出伴侣蛋白吗？您指的非变性胶是什么胶？
3. 我这个蛋白纯出来就是要做二维或三维NMR的，如果是二三聚体的话，图谱能明显地看出来吗？
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好好学习，天天向上！
9楼2016-09-26 11:11:52
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huaizhenkai

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by walking dead at 2016-09-26 09:24:01
如你所说，Superdex 75柱子分离范围为3-70 kd，如果杂蛋白是大于70kd，理论上你杂蛋白是外水全排阻，可以实现分离。但是杂蛋白的分子量也有些是小与70kd的。所以这个分子筛实现你目标蛋白更高纯度的纯化很难实现。你 ...

嗯嗯，我现在想先确定是不是二三聚体，如果是的话，离子交换还是分不开的吧，因为等电点还是一样的啊。
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10楼2016-09-26 11:13:44
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